当前世界环境

介绍

假单胞菌是革兰氏阴性，非孢子形成，杆状细菌的一个属。它们通常存在于土壤、水和腐烂的物质中，包括一些植物和动物病原体。铜绿假单胞菌是双重评估的典型例子;在临床环境中，它是最重要的机会致病菌之一，是大多数医院感染的原因。¹然而，在环境保护领域，这种生物对人类健康的影响还没有被认识到，这种物种的菌株通常用于生物修复目的。假单胞菌spp。已经有效地雇用作为生物控制代理商，并且市场上的一些商业产品已经表明了它们的功效，但纯化的施用电影的应用，作为胁迫或杀菌剂与其他抗菌因素组合的效果将肯定会提高兴趣。假单胞菌spp能产生许多化合物，这些化合物对疾病的控制和植物的生长都有帮助。这些抑制化合物包括铁载体、HCN、降解胞外酶如几丁质酶、蛋白酶、纤维素、β-1,3葡聚糖酶和抗生素如吡咯硝基、pyoluteorin和非那嗪。^2,3,4

材料和方法

土壤样本的集合和选择性孤立假单胞菌spp。

首先从印度喜马偕尔邦Ponta Sahib的七个不同地点随机采集土壤样本。取样地点包括车库、焊接车间、加油站和其他污染场所。样品采集在无菌塑料袋中，贴好标签后立即购买到实验室。72小时内进行土壤电镀。样本的收集。选择性的隔离假单胞菌采用假单胞菌分离琼脂(Pseudomonas Isolation Agar, PIA)培养基，37℃培养^ºC为24小时。最终通过重复的亚培养，然后进行镉耐受试验来获得纯培养物。

细菌分离物的特性

纯粹的文化假单胞菌通过形态学和生化鉴定，鉴定出耐镉品种^5、6并最终通过16S rDNA测序确认。

16S rDNA测序鉴定

纯培养培养至log阶段，从细菌分离株中提取基因组DNA。⁷通过使用正向底漆和反向引物进行16S rRNA基因的扩增。16S rRNA基因的〜1.4 kB-PCR产物用于DNA测序。测序后，通过BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi）和核科群数据库项目（http://rdp.cme.edu/）分析序列以查找最近的同源序列。基于其最大同一性分数选择前十个同源序列。序列比对齐，并构建距离基质，然后构建系统发育树的构建。

筛查Cadmiumtolerance

对所有分离株进行了金属耐受性检查。测定了对镉(CdCl)的最低抑菌浓度(MIC)₂)，通过逐渐增加营养琼脂(NA)平板上的镉浓度，直到菌株不能在平板上产生菌落。初始浓度为50μg/ml，在最后浓度上培养的培养物在平板上划线转移到更高浓度的培养物。当分离菌不能在平板上生长时记录MIC。同时测定了对铜、铅、锌的最低抑菌浓度。

恢复菌株的抗生素敏感性和耐药模式

采用Kirby-Bauer纸片扩散法对分离菌株进行药敏试验⁸抗生素光盘是从HIMEDIA获得的。本研究使用的抗生素有阿米卡星、阿莫西林、氨苄西林、头孢氨苄、头孢曲松、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素、甲氧西林、氧氟沙星和四环素。抑菌圈直径测量至最接近mm，按标准抗生素盘敏试验方法将分离菌株分为耐药(R)、中药(I)和敏感(S)。

盆栽试验 细菌接种剂的制备

铜绿假单胞菌细菌接种物的制备考虑了对镉耐受性较强的SN4。将分离物接种于营养液中，在28±2℃，120 rpm的摇床培养箱中保存48小时。孵育期后，在45 ml蒸馏水中加入5 ml肉汤配制生物肥料，进行盆栽试验。

奥里扎苜蓿幼苗收集和预播种处理

的种子栽培稻是在阿萨姆邦马西普尔的KrishiVikas Kendra收集的。种子大小、重量均匀。干净的种子浸入水中;丢弃漂浮的种子，选择沉淀在容器底部的种子。种子表面用95%酒精消毒30秒，然后用0.1% (w/v) HgCl消毒₂用无菌蒸馏水冲洗5-6次。⁹然后将种子放入含有霍格兰溶液的无菌培养皿中保存过夜。

锅试验研究

瓦罐(24厘米x12厘米x12厘米)装满了消毒过的沙壤土。所有的花盆上都播种了种子，以研究其作用铜绿假单胞菌SN4ON拍摄生长选用 苜蓿在含镉土壤中播种(20 mg/kg和50 mg/kg土壤)。通过在镉污染土壤中添加生物肥料配方进行盆栽试验。连续3周，每天记录幼苗的萌发情况及其生长规律。

统计分析

在进行POT实验后，SPSS 16.0用于分析统计数据。描述性统计数据计算所有复制的手段与标准错误和偏差。进行多种比较试验以评估每种细菌分离株的有效性。当对差异分析（ANOVA）显示出显着的影响时，TUkey -b检验(假设方差相等)和G一个采用mees - howell检验(假设方差不等)，组间比较P<0.05和P<0.01。

结果 选定菌株的特性分析

共有三十二假单胞菌spp。被隔绝从Phonta Sahib，印度喜爱的Pradesh。总活计数范围为32 x 10⁴(CFU/g)至43 X 10⁴(CFU / g)。所有菌株均为革兰氏阴性棒。多数菌株为吲哚阴性、MR阴性、VP阴性和脲酶阴性。氧化酶试验假单胞菌分离株呈阳性，表明为需氧菌株。观察到枸橼酸试验阳性结果，推断这些生物利用枸橼酸作为碳和能量的唯一来源的能力。分离菌株还能产生一种酶“硝酸盐还原酶”，导致硝酸盐(NO .)的减少_3.)．选择耐镉性最高且盆栽试验结果显著的菌株进行16S rDNA测序。利用Ps-11 (1393 bp)序列和数据库中具有代表性的序列生成邻域连接树。经观察，应变码Ps-11与种的序列相似性最大铜绿假单胞菌具有相同的系统发育分支(图1)铜绿假单胞菌并提交给NCBI-GenBank。由此获得的登录号为KF44770。

图1:基于相邻法构建的部分16S rDNA序列，研究样本(Ps-11)与代表性物种的系统发育关系。研究样品(Ps-11)已提交至NCBI-Genbank，获得的登录号为KF44770 (铜绿假单胞菌应变SN4)。 点击这里查看图

最小抑菌浓度(MIC)

所有细菌分离物表现出对镉的耐药性，最小抑制浓度（MIC）从300μg/ ml至1800μg/ ml范围内。对氯化镉的分离细菌菌株的耐受容量存在巨大变化。约53％的测试分离物在1000μg/ ml CDCl处耐受耐受₂浓度。铜绿假单胞菌SN4(分离代码:Ps-11)对镉具有较高的抗性，MIC为1800μg/ml。多金属容限试验表明，其MIC值为铜绿假单胞菌铅的SN4为170μg/ml，铜为60μg/ml，锌为1800μg/ml(表1)。

表1:所有分离菌株的最低抑菌浓度

隔离代码	最低抑制浓度
	镉	铅	铜	锌
Ps-1	1400µg / ml	150µg / ml	50µg / ml	1800µg / ml
Ps-2	1100µg / ml	80μg/ ml	60µg / ml	1500µg / ml
台	800µg / ml	100µg / ml	40μg/ ml	1600µg / ml
Ps-4	700µg / ml	110µg / ml	30µg / ml	1100µg / ml
Ps-5	1000μg/ ml	150µg / ml	40μg/ ml	1600µg / ml
Ps-6	1200µg / ml	160μg/ ml	50µg / ml	1700μg/ ml
Ps-7	700µg / ml	120μg/ ml	50µg / ml	1200µg / ml
Ps-8	400µg / ml	100µg / ml	30µg / ml	1000μg/ ml
Ps-9	1100µg / ml	140µg / ml	20µg / ml	1200µg / ml
PS-10	1000μg/ ml	150µg / ml	50µg / ml	1300µg / ml
PS-11.	1800µg / ml	170µg / ml	60µg / ml	1800µg / ml
PS-12	600μg/ ml	100µg / ml	60µg / ml	1000μg/ ml
PS-13	1700μg/ ml	160μg/ ml	60µg / ml	1600µg / ml
PS-17.	1400µg / ml	170µg / ml	60µg / ml	1800µg / ml
PS-15	300μg/ ml	100µg / ml	30µg / ml	1000μg/ ml
PS-16.	500µg / ml	120μg/ ml	20µg / ml	900µg / ml
PS-17.	1200µg / ml	170µg / ml	60µg / ml	1300µg / ml
PS-18.	800µg / ml	140µg / ml	50µg / ml	1000μg/ ml
PS-19.	800µg / ml	150µg / ml	40μg/ ml	1300µg / ml
PS-20.	600μg/ ml	120μg/ ml	30µg / ml	900µg / ml
PS-21	1200µg / ml	150µg / ml	60µg / ml	1400µg / ml
PS-22.	600μg/ ml	120μg/ ml	50µg / ml	1300µg / ml
PS-23	400µg / ml	120μg/ ml	40μg/ ml	1300µg / ml
PS-24	400µg / ml	120μg/ ml	40μg/ ml	1000μg/ ml
PS-25	1500µg / ml	130µg / ml	40μg/ ml	1200µg / ml
PS-26	1200µg / ml	120μg/ ml	50µg / ml	900µg / ml
PS-27.	1800µg / ml	170µg / ml	60µg / ml	1800µg / ml
PS-28	1000μg/ ml	130µg / ml	40μg/ ml	1500µg / ml
PS-29.	1200µg / ml	120μg/ ml	30µg / ml	1200µg / ml
PS-30.	600μg/ ml	120μg/ ml	30µg / ml	900µg / ml
PS-31	300μg/ ml	100µg / ml	30µg / ml	1000μg/ ml
PS-32.	1000μg/ ml	130µg / ml	40μg/ ml	1500µg / ml

抗生素敏感性及耐药模式铜绿假单胞菌SN4

大部分的假单胞菌本研究分离出的菌群对一组抗生素表现出高度耐药模式。据观察铜绿假单胞菌SN4对阿莫西林、氨苄西林、头孢氨苄、头孢克肟、卡那霉素、甲氧西林和四环素耐药。其他研究人员也证实了这一事实，即多种金属耐药细菌分离株对一组抗生素表现出高耐药性。^10.

的影响铜绿假单胞菌SN4对栽培稻接种在含镉土壤中

接种和P．绿脓杆菌sn4能显著促进种子萌发和生长栽培稻与控制集相比。幼苗萌发20 d后，多次比较结果表明铜绿假单胞菌土壤中镉浓度为50mg/kg时，SN4比未接种的对照盆栽幼苗生长速度提高了12%(表2)。然而，土壤中镉浓度为20mg/kg时，萌发速度略有提高(平均差异= 0.96±0.63 cm)，这没有统计学意义。结果表明，镉的生物吸收量最大铜绿假单胞菌土壤中镉含量升高。

表2：幼苗生长栽培稻接种抗镉剂 铜绿假单胞菌 SN4在镉加入土壤

实验装置	茎长(厘米)
	土壤镉浓度为20mg/kg	50mg / kg土壤下的Cd
控制(不含Cd和铜绿假单胞菌SN4）	31.66±0.42	31.66±0.42
未征收的控制（仅限CD）	27.62±0.35	25.18±0.26
铜绿假单胞菌SN4 + Cd	28.58±0.98ns	28.18±0.49 *

值为5个重复的平均值±标准差;ns =不显著;*= P<0.01显著;与未接种对照相比。

讨论

镉对我们的环境，尤其是植被的影响引起了越来越多的关注，这导致了人们对生物修复策略的兴趣增加。显微镜下的证据显示分离出来的细菌是革兰氏阴性的杆状细菌。此外，生化测试和16S r DNA确认分离物为铜绿假单胞菌．随培养板上镉浓度的增加，菌落的生长(cfu/g)在任何给定时间间隔内都比未加金属修饰的对照组下降。在较高的金属浓度下，微生物负荷较低，与安岩武的研究存在相关性et al。 ^11.．目前的研究表明，镉的抗性模式假单胞菌隔离。根据分离菌株的MIC值和抗生素谱图，并由Bruins进行研究et al ., ^12.，假单胞菌sp。显示抗各种有毒物质，重金属和抗生素。铜绿假单胞菌SN4对镉的耐受性可达1800μg/ml，并表现出对多种金属的耐受性。重金属的毒性水平影响了内膜和细胞器的结构和渗透性，导致酶活性抑制、营养失衡、光合速率和蒸腾速率降低^13、14，刺激自由基和活性氧的形成，导致氧化应激^15.，抑制种子萌发、幼苗生长、生殖发育、种子产量和种子质量^16.并诱导作物植物中有害解剖和超结构性变化^17、18在目前的研究中，应用铜绿假单胞菌在含镉土壤(20和50mg/kg)下，SN4对幼苗生长和萌发均有显著促进作用。接种20 d后，在土壤中加入镉并施用铜绿假单胞菌与未接种的对照盆栽相比，水稻植株获得了显著的幼苗生长。一些研究已经证明，抗镉和促进植物生长的细菌可以保护植物免受金属的毒性影响^{19日,20日,21日}．整体实验表明铜绿假单胞菌SN4(基因库Acc。(No: KF44770)能促进生长栽培稻在受镉污染的农田中(图2)，因此需要留出长期农业用地。还需要进一步的研究来扩大有关的知识铜绿假单胞菌SN4在用于商业目的之前。

图2:效果铜绿假单胞菌SN4对苗期生长的影响栽培稻接种在土壤中50mg / kg镉并与对照组进行比较（在第一个控制罐中，不加入镉和细菌淋巴壳，从而达到正常的幼苗生长。但是，在第二罐中，浓度在50℃下加入镉土壤中的mg / kg;展示镉在幼苗萌发和生长中的毒性作用。在最终的测试罐中，添加铜绿假单胞菌菌株SN4导致如表2所示的显着幼苗生长。 点击这里查看图

结论

本研究从印度喜马偕尔邦Ponta Sahib污染场地分离出32种耐镉细菌。大多数菌株表现出多金属耐受性，对一组抗生素有耐药性。铜绿假单胞菌SN4对镉的耐受性最高，可考虑进行盆栽试验研究。与对照处理相比，接种铜绿假单胞菌土壤镉浓度为50mg/kg时，sn4对幼苗萌发有影响。已经观察到，微生物接种改变了土壤中金属的生物有效性，在细菌接种20天后，幼苗的生长速度提高了12%。从目前的研究可以明显看出，针对高浓度重金属的HMRB的应用将提高重金属污染土壤的修复能力。评价其生物吸收潜力尚需进一步研究铜绿假单胞菌通过田间试验研究了SN4的作用机理。

致谢

作者希望对印度政府新德里生物技术部门表示感谢，感谢他们在印度Silchar Gurucharan学院建立了机构级生物技术中心和生物信息学中心。作者还向印度喜马偕尔生命科学研究所表示感谢，感谢他们在当前研究的初始阶段提供的帮助。

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