当前的世界环境

介绍

蓝藻是一种产氧的光自养原核生物，已知与水稻共生，并在农业中被开发，作为稻田补氮生物肥料进行特殊接种。¹由于其固氮能力和对初级生产的重要贡献，在土壤中受到了广泛的关注。稻田生态系统就蓝藻对光、水、高温和养分的需求提供了有利于蓝藻生长的环境。²蓝细菌的分类系统通常取决于形态学属性，然而，它们并不总是一致的，因为它们可能在培养条件的变化方面表现出差异。^3.因此，近年来，涉及传统形态学、生化和分子数据的多相方法已成为必要。

根据传统的分类系统，属眉藻属如C. Agardh（1824）所描述的，属于东部垂耳大学和家族rivulariaceae。^{4 - 5}这是一个多态属，其一般特征包括:幼毛状丝仅在毛状体的一端有顶生异囊，成熟毛状体从基部开始逐渐变细，顶端有顶生异囊，营养细胞盘状、等径或圆柱形。^5.最近的研究表明，需要多相方法(使用形态学和分子数据)来确定眉藻属分类赛。^6.rivulariaceae被认为是具有锥形毛细胞的最重要的复杂蓝藻，除了具有末端杂物的雌激素形成的短阶段，尽管在一些物种中，中间杂物也存在，并且细胞分裂在很大程度上将其局限于杂物附近的区域^7.．属的种类眉藻属蓝绿色，丝状，基部有异囊，在盐和淡水环境以及亚空中和空中都有。^8－9

另一个属Microchaete， [Thuret 1875] Bornet et Flahault 1886，是一种丝状的异囊藻蓝藻，属于微毛藻科，蓝藻科，一般在池塘、稻田、淡水湖泊和海洋环境中发现。^10-12通常花丝一端附着在基质上，单个或有许多花丝的集落，不规则地排列或形成草皮。毛状体被一非常明显的鞘包围，大多数狭窄和锥形朝向末端，异囊基部和也经常插入。这两属的细胞分裂在形态学上有所不同眉藻属在细胞分裂时，主要发生在毛状体靠近异囊的部分Microchaete显然朝着顶点和细胞伸长率达到这个地区。^13.因此，本研究的目的是从印度南阿萨姆邦Karimganj地区的稻田中分离出两株蓝藻菌，并对其进行形态学、生化和分子分析。

材料和方法

从土壤样品中分离菌株

土壤样本是从南阿萨姆邦Karimganj区选定的稻田中采集的。压力眉藻属sp。(AUS-JR / MT / nt - 036)was isolated from the rice field of Deodhar (24°69'862'' N, 92°45'115''E) andMicrochaetesp.(AUS-JR/MT/NT-037)，分别来自24°42′059”N, 92°27′164”E的Sone beel稻田。将10克土壤样品转移到装有90ml无菌蒸馏水的250ml烧瓶中，摇匀(120转/分)30分钟。^14.连续稀释(10^－2,10^－1)，并将1ml等价物涂布于含BG 11的琼脂平板上_O.摘要媒介。^15.得到的无菌蓝藻分离菌在实验室条件下，在24°C±1、2000-3000lux的光照下保持在分离培养基中。反复传代多次，直到获得纯无菌培养。

基因分离物的表型表征

测定了蓝细菌分离株的形态学表征。借助于Leica DM1000显微镜和形态学特性，如晶粒的结构和颜色，长丝长度和宽度，使纯培养物的显微镜观察和显微照片。植物细胞的衰减，形状和大小，杂物，颜色，厚度和鞘的厚度和距离以及孢子的存在或不存在的缺陷，颜色，厚度和距离。使用分类键完成菌株的鉴定。^16.

生长特征和生化估计

生长模式，生物化学成分（可溶性蛋白质和总碳水化合物）和颜料曲线（叶绿素一种检查了两种蓝藻分离株的总类胡萝卜素和植物胆素）。通过在叶绿素方面分析物种生物质来确定蓝细菌生长模式一种专注。^17.采用改进的劳瑞法测定可溶性蛋白^18.通过蒽酮方法估算总碳水化合物。^19.藻胆蛋白和类胡萝卜素含量也进行了测定。^{20日至21日}

16S rDNA基因扩增及测序

按标准方法从指数生长培养基中提取两株分离的蓝藻菌株的基因组DNA。^22.放大的16 s rDNA基因使用CYA106 f(5“-GGACGGGTGAGTAACGCGTGA-3”)和CYA781r (a)(5‘-GACTACTGGGGTATCTAATCCCATT-3’)的正向和反向引物分别应用生物系统与以下温度热循环初始变性在94°C 5分钟,30 94°C的周期为1分钟,58为45°C年代,72°C持续1min, 72°C持续7min^23.．使用2μl（50ng）的提取的DNA和PCR反应混合物制备50μl反应混合物，并由2x Genet Bio premix pH 9.0组成（Prime Taq TM DNA聚合酶1单元10μl，20mM Tris-HCl，80mM KCl，4 mm mgcl.₂dATP、dCTP、dGTP、dTTP各0.5mM) 25µl，正反引物各1µl, MiliQ水21µl。

系统发育分析与树的构建

使用基本的本地对准搜索工具（BLAST）搜索（http://www.ncbi.nim.nih.gov/blast），检查所获得的序列与可用数据库中的其他序列进行同源性。然后将基因序列提交给美国生物技术信息（NCBI）Genbank，我们的国家。，在各自的加入号码下。使用Mega6分析平台构建系统发育树^24.包括可用的蓝藻基因序列以及本研究中使用邻居连接法确定的序列。^25.使用CLUSTALW对准实用程序对准序列，以产生靶菌株的16S RDNA序列的工作对准。进化距离被计算并表达为每个站点的基替代数量。通过引导分析确定内部节点的统计显着性水平（1000个数据重新采样）。^26.

核苷酸加入数字

菌株的16S rRNA基因的序列已经沉积在NCBIGegank和各自的载体数中。

结果与讨论

菌株的形态学特征

在光学显微镜下研究了孤立的蓝细菌菌株的形态。两种菌株的形态特征如下。

眉藻属sp。(AUS-JR / MT / nt - 036)

菌体在培养皿上呈丝状结构;蓝色的，绿色的或棕色的;稍弯曲，单生，7-10µm宽，基部具薄的无色鞘;毛状体棕绿色，缢缩在十字壁上;细胞呈二次型，短或长于宽，长4-7µm，宽3-7µm;单杂囊，基部和球形，4-5µm宽。(图1 a, c和e)。

Microchaetesp。(AUS-JR / MT / nt - 037)

培养皿上的培养皿是丝状的，黑色的颜色，形成毛茸茸的薄膜;滴度孤零性，略微衰减到底;细胞Quadrate8-9μm宽，长9-11μm;细胞内容在十字壁上颗粒状;基础杂物球状，闰杂物壬酸;鞘明显，厚，无色，薄层，7-8μm宽，长6-7μm。（图1b，d和f）。

生长特性、色素及生化特性

从叶绿素的角度分析了两种菌株的生长曲线一种表明了这一点Microchaete发现具有更长的指数阶段的应变是较慢的种植者相比眉藻属菌株的色素分析及生化特性如表1所示。较高的叶绿素一种(13.84μg毫升^－1)和藻胆蛋白(103.35 mg g^－1）内容被发现眉藻属紧张而另一个Microchaete总类胡萝卜素含量较高(3.11 μg mL)^－1）.可溶性蛋白质浓度通过眉藻属sp。来自Deodhar米场的分离为79.80μgml^－1蛋白质含量最低的是MicrochaeteSP。（42.47μgml^－1）.总碳水化合物含量累积为Microchaetesp. (115.71 μg mL^－1）较高，而眉藻属sp。仅显示50.14μgml^－1．

图1:研究菌株的显微照片。平板视图- a)眉藻属sp。(AUS-JR / MT / nt - 036)和b)Microchaetesp。(AUS-JR / MT / nt - 037); Individual trichomes showing heterocyst (h) - c)眉藻属sp。，d）Microchaetesp。液体培养- e)眉藻属sp。(AUS-JR / MT / nt - 036)那f)Microchaetesp。(AUS-JR / MT / nt - 037) 点击此处查看数字

图2:叶绿素的生长曲线分析一种浓缩A.眉藻属sp。(AUS-JR / MT / nt - 036) B。Microchaetesp。(AUS-JR / MT / nt - 037) 点击此处查看数字

分子和系统发育分析

获得了该菌株16S rRNA基因的部分序列，并与其他亲缘关系较近的非stocalean成员进行了比较眉藻属那Microchaete和Tolypothrix.从GenBank数据库中检索到的印度和世界其他地区的物种。利用Neighbor-Joining方法推断其进化历史。图3显示了各菌株之间的关系及相关序列的系统发育树。图中给出了分枝长度和= 0.14439346的最优树。分支旁边显示了在引导测试中关联类群聚集在一起的复制树的百分比(1000个重复)。进化距离是用p-距离法计算的，以每个位点的碱基差数为单位。密码子位置为1 +2 +3 +非编码。所有包含空白和缺失数据的位置被消除，最终数据集中总共有567个位置。

图3:基于16S rRNA基因分析的系统发育树，显示得到的序列在 本研究(有标记的)。 点击此处查看数字

在系统发育树中，眉藻属sp。(AUS-JR / MT / nt - 036)was most closely related to the sequences ofTolypothrix.sp。来自墨西哥的PCC 7504眉藻属Brevissima.来自日本的大枝与其他的眉藻属物种。最近的分子研究是一致的，将Genus放在岩土上Tolypothrix.以及其他相近的属。^27.然而Microchaetesp. (AUS-JR/MT/NT-037)与其他物种形成了一个强壮的分支眉藻属物种和Tolypothrix.来自日本的物种，密切相关微芯片文凭私人来自墨西哥的CCALA 811，自启动值高。

表1所研究菌株的色素分析及生化特性(平均值±SD)

核苷酸加入数字

将获得的序列提交给NCBI，并附上相应的登录号眉藻属sp. (AUS-JR/MT/NT-036) - KM252910和Microchaetesp. (us - jr /MT/NT-037) - KM252911。

研究了作为印度不同地区的生物土藻的蓝绿藻的系统账户，并进行了详细的形态学研究眉藻属物种是研究过的。^28.目前的研究表明，被分离的眉藻属菌株显示出高叶绿素一种可溶性蛋白质含量与积累量不同眉藻属从甘蓝和Pokharan地区隔离的物种，拉贾斯坦邦，这些都在叶绿素和可溶性蛋白质含量方面差，但显示出氮固定的显着潜力²⁹不相似可能是由于栖息地的差异从它们被隔离的地方的差异。叶绿素含量范围为11.16μgml^－1至3.51 μg mL^－1在树状细菌菌群中眉藻属还报道了来自印度的不同地理位置的孤立。^30.在另一份报告中，多相特征念珠藻属公社从水稻种植的农业生态系统中分离的菌株也进行了研究。^31.与Berrendero的发现相似等, 2008^6.在哪里Rivularia和眉藻属在系统发育推断中，我们的研究表明有代表性的属Calothrix，Microchaete.和Tolypothrix.综合症，因此呈现出巨大的遗传分歧。^6.虽然16S核糖体基因分析一直是推断系统发育和建立进化关系的一种选择方法，但形态学数据和分子数据一直被用于获得有意义的推断，以更精确地确定蓝藻的分类地位。^32-33因此，本研究采用多相分析的方法，包括形态学和分子程序，以研究分离菌株的遗传多样性和生态意义眉藻属和Microchaete被证明是强大的，有用的。

确认

作者感谢项目基金(塞尔维亚/SR/SO/PS/96/2010)下的印度政府新德里科学技术部提供的财政援助。我们感谢印度政府生物技术部在研究工作期间提供的开展这项工作所需的设施。

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