当前的世界环境

介绍

由于植物的优点，包括高科核系统对植物系统的外来基因表达和重组蛋白质产生的影响，包括高产品质量，成本非常低，扩大量高，糖基化的轻微差异，低风险污染，相对较低的道德问题，廉价的储存成本[（Ma等，2003） - （Egelkrout等，2012）]。根据国际服务的国际服务，收购Agri-Biotech申请（ISAAA）报告“2012年，从1996年的170万公顷的170万公顷达到了前所未有的100倍，2012年的170万公顷 - 这使得生物技术作物最快的作物技术在近期历史 - 原因 - 他们提供福利“（James等，2012）。为了转基因植物，需要调节基因上游的调节启动子以确定外国基因表达的部位，水平和时序（Egelkrout等，2012）;这些启动子通常分为五组：1）组成型启动子，其在大约所有细胞类型中导致最高量的表达。在大多数植物细胞中高度表达的植物生物技术中最广泛应用的组成型启动子是花椰菜马赛克病毒（CAMV）35s启动子（Yoshida等，2000）。2）诱导型启动子，其导致在存在或不存在因子中的存在或不存在诸如伤害或病原体侵袭，化学或物理诱导的因素中激活或停用，并且优先于没有干扰转基因的生命周期的发育阶段植物（Corrado等，2009）。3,4）组织特异性和显影 - 阶段特异性启动子是将转基因在特定组织中的表达引起的那些，例如叶片，种子，根部等或在植物发育的特定阶段，在某些情况下， increase the stability of the produced protein [(Ma et al., 2003)- (Egelkrout et al., 2012)]. 5) Synthetic promoters which are composed of the regulatory elements of natural promoters (Sharma et al., 2009).

重组蛋白的定位是植物转化的相当方面，可能影响蛋白质的保存和纯化程序（Wilken等，2012）。考虑到所选择的启动子，外来蛋白质的定位将是可预测的，并且报告基因的应用将促进该程序。使用GUS基因作为报告者，可以评估新型启动子的功能，以便可以对基因表达的急性控制进行适当的选择。此外，常规组织化学分析的可用性将极大地促进植物发育过程中基因表达模式的研究。此外，这些方法能够更快且敏感地筛选转化的细胞和组织。

作为组成型启动子，CAMV 35S启动子应该自然地将外源基因的表达直接引导到大约所有细胞和组织类型中;然而，存在一些证据表明，特别是植物的特定细胞和组织的不同基因表达意味着不同的表达模式（Anuar等，2011）。

本研究旨在检测转基因油菜不同组织中GUS的活性，以揭示CaMV 35S启动子定向基因的表达。

材料和方法

这农杆菌肿瘤术含有PBI121二元载体的菌株LBA4404用于植物转化。载体的T-DNA区域有NPT IICaMV 35S启动子控制下的GUS基因。

转型子叶植物的外植体农杆菌

这芸苔栗鸟var. PF 7045-91和SLM种子表面灭菌后，在含有半强度MS (Murashige et al.， 1962)培养基的罐子中发芽，并在40-50 μ m的光周期16/8 h^-2S.^-1温度强度和25°C。这农杆菌在LB (Luria-Bertani)肉汤中(含50mg^-1卡那霉素下在28℃下振荡（180 rpm）的。这农杆菌文化与OD._650.= 0.8以3000rpm离心15分钟。将颗粒重悬于感染培养基含量，在pH5.2处的5％葡萄糖，并用于转化外植体。仔细兴奋，子叶（带5-7毫米的叶柄）7天龄幼苗和14天幼苗的幼苗。只接种子叶子和幼杆块的叶柄农杆菌悬浮液5至10s。使用滤纸擦拭所有外植体，然后嵌入MS培养基中，没有任何激素在pH 5.2，并在28℃下在暗条件下保持温室。共培养后，将备用植物转移到愈伤组织诱导培养基（CIM）（MS培养基中含有1毫升的MS培养基^-12,4 - d, 30 gl^-1蔗糖，7 GL^-1琼脂，200毫克^-1头孢噻肟和15 MGL^-1Kanamycin在pH5.8）中，然后转移到芽诱导培养基（SIM）（MS培养基含有1.5 mgL^-1苄基腺嘌呤，30 GL^-1蔗糖，7 GL^-1琼脂，200毫克^-1头孢噻肟和15 MGL^-1Kanamycin在pH5.8），并在相同的新媒体上每两周转移一次。在共培养后直接将子叶蛋白质外植体转移到SIM培养基中。6周后，从子叶植物的外植体激发绿色卡霉素抗芽并转移到芽成熟培养基（SMM）（含有MS盐的MS培养基，20GL^-1蔗糖，7 GL^-1琼脂、15球型^-1卡那霉素，200 mg^-1PH 5.8的头孢噻肟）。2周后，将绿色芽转移到根诱导培养基（RIM）（含有2毫升的MS培养基^-1吲哚丁酸，20 GL^-1蔗糖，6 GL^-1琼脂，200毫克^-1头孢噻肟和15 MGL^-1卡那霉素，在pH 5.8）。卡那霉素抗性的绿色植物，其能够产生根，显影根部后，分别转移至蛭石，蛭石和土壤混合物，和土壤。

转基因植物中GUS基因的PCR确认

根据CTAB方法（Murray等，1980）萃取卡那霉素抵抗植物的基因组DNA，以便用于转基因植物中的GUS基因。利用包括GUS + 2和GUS -4的特异性引物。引物序列如下：

GUS-4：5'-CCGGCATAGTTAAAGAAATCATG-3'

格斯+ 2:5“-GGTGGTCAGTCCCTTATGTTACG-3”

通过技术偏移循环液如下，如下：30循环在94℃下的变性1分钟，在61℃下退火1分钟，在72℃下引物延伸1分钟，然后在72处进行最终延伸7分钟℃并在94℃下初始变性4分钟。

GUS分析

通过分解X-Gluc的分解产生蓝色的GUS基因表达和产生的β-葡糖醛酶的评价在含有50mM磷酸盐缓冲液（pH7），1mM X-Gluc，1mM EDTA的缓冲液中进行，0.001％的Triton，10mMβ-巯基乙醇。将转基因植物的茎，叶柄和叶片在缓冲液中在37℃下在37℃下孵育过夜。为了观察植物组织中的蓝色，通过96％乙醇进行叶绿素的消除。

横断分析

通过手动横截面分析转基因植物的营养组织。将所得部分通过胭脂碱 - 背心染色并使用光学显微镜观察。

结果和讨论

使用农杆菌-介导转化，得到PF7045-91和SLM品种的转化植株，转化率分别为10.2%和12%。图1显示了转化和未转化的植物。未转化植株在选择培养基上变成白色/紫色;转化植株保持绿色，表型正常。

图1：卡那霉素的效果作为外植体子叶一个）的转化的小植株保持绿色在卡那霉素存在的选择剂;b）在未转化的小植株成为卡那霉素存在白色/紫色。 点击此处查看图

对GUS基因的PCR验证表明，该基因存在于所有假定的转基因株系上。图2为显示GUS基因的520 bp PCR产物。这一结果表明，二元载体的T-DNA区域已成功转移到植物细胞中。

图2：具有特异性引物的转基因植物中GUS基因的PCR扩增。第3、5和6道是经过改造的植物线;Lane 1是pBI-GUS阳性对照;4号道是100 bp的混合梯。 点击此处查看图

转基因植株的组织呈现蓝色，表明GUS基因的表达和β-葡萄糖醛酸酶的功能。在73%的抗卡那霉素植株中，在不同强度下均呈现蓝色(图3)。在叶片横截面上，维管束中GUS酶活性极高，除韧皮部外，维管束射线和髓薄壁组织均呈现极显著的蓝色。皮层和髓的实质细胞以及表皮细胞(包括毛状体)的染色也不同。

图3：转基因植物的叶横截面。叶子展示GUS表达在血管束，血管射线，髓薄膜，Collenchyma，richomes和表皮。 点击此处查看图

在转基因植物的叶柄横截面中，在Phloem和Collenchyma组织中观察到蓝色（图4）。

图4：转基因植物的叶柄横截面。GUS活动在Collenchyma组织中非常庞大显示。 点击此处查看图

在茎横截面中，在Phloem组织和血管射线中高度观察到由X-Gluc分解产生的GUS基因和蓝色的外观（图5）。Gus活性在Camv-Gus植物杆的血管环周围的Phloem组织中高度看出（Jefferson等，1987）。表达模式在接合内部和外部验证的Phloem薄壁症中标注和观察到（esauk等，1977）。在一些转化植物的茎中，观察到GUS活性的可变分布。

图5：转基因植物的茎横截面。在韧皮肌和血管射线中高度观察到GUS表达。 点击此处查看图

这是绝对清楚的是GUS表达的图案分别在植物细胞中复杂的（Basu等人。，2004）。预期在不同的细胞类型的植物要观察不同的代谢活动;因此，GUS基因的表达受不同的生物化学，分子和生物因素，在转录和翻译的速率呈现（费耶等人，2009）;这种差异可以通过本发明的发现来暗示。可替代地，由于韧皮部细胞的非常小的横截面区域，所观察到的强烈的蓝色可以是指每单位面积更大的细胞数目（Jefferson等，1987）。在细胞周期的S期，CaMV 35S启动子是如此优先活性，与所观察到的GUS表达型这样的一种解释可能意味着在这些组织内的细胞分裂（Nagata等人，1987）。从CaMV启动病毒复制的35S转录作用，这句话起源;一些其他植物DNA病毒如双生病毒具有在韧皮组织这样的复制[（Schubert等人，2004）和（迪南等人，2004）]。此外，CaMV 35S启动子具有两个结构域：（。阿努阿尔等人，2011）域A有助于维管束表达分生组织表达和域B的结果。考虑到低的或在高等植物中没有内源性GUS活性，观察到的定位可能反映了在不同小区中CaMV 35S启动子的表达水平的真正的区别。

使用农杆菌介导的转化，具有不同副拷贝的转基因细胞和外源基因的植物以及不同的整合位点。因此，转化的植物将表达具有不同量的外源基因。这种差异可能是由于基因集成的各种定位，内源性蛋白因子的影响，以及在转录或转录过程中沉默[（Wakimoto等，1998），19和（Schubert等，2004）]。高稳定性基因插入率可能导致基因表达水平不稳定或降低。转型农杆菌将导致低速率的外源基因插入和DNA积分将随机随机，其倾向于在基因组的远端染色体区域中插入[（Dong等，2001）和（Gelvin，2003）]。

现在，人们对转基因植物及其产生外源蛋白的特性有了深刻的认识。如果没有合适的启动子，外源基因将被复制，但不会表达;因此，使用合适的启动子将导致基因的成功表达。尽管CaMV 35S启动子是一个强大的启动子，但考虑到基于细胞类型和细胞周期的转录过程，它不应该被认为是“组成型”的。大量启动子的可用性使得利用植物作为生产外源蛋白质的工厂的前景非常广阔。目前，关于植物转化和外源基因表达的研究进展良好，今后的工作可能会更有启蒙性。

致谢

我们感谢Kharazmi大学植物发育生物学实验室的员工，植物生物技术实验室为所有辅助。该研究得到了Kharazmi University和国家基因工程学院和生物技术（Nigeb）。

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