当前世界环境gydF4y2Ba

介绍gydF4y2Ba

为了满足对食物和饲料的需求，像农业这样的人为干扰在印度喜马拉雅地区正变得越来越密集。印度喜马拉雅地区需要更多的养分投入，从而导致土壤有机质的下降。通过化肥和杀虫剂的农业投入对生态系统产生不利影响gydF4y2Ba（gydF4y2Ba杨等人gydF4y2Ba．gydF4y2Ba, 2000)gydF4y2Ba．gydF4y2Ba微生物对不断变化的环境条件非常敏感，因此是环境健康的有效功能指标。土壤微生物介导许多生物化学反应，并通过生物化学信号进行交流，促进生物地球化学循环gydF4y2Ba（gydF4y2Ba科尔特和格林伯格，2006年;Kibblewhite等人，2008年gydF4y2Ba）gydF4y2Ba．这些反应的主要组成部分是土壤微生物酶，它们也暗示了土壤质量随气候、温度、肥料等环境和人为因素的变化。土壤酶调节养分供应并催化包括有机物分解在内的几种反应(Burns, 1983;Sinsabaugh等gydF4y2Ba．gydF4y2Ba和营养循环(Tabatabai, 1994;迪克,1997)。此外，它对环境信号反应迅速，因此利用土壤酶活性作为土壤质量指标将揭示土壤的生物状态(Melero et al .)gydF4y2Ba．gydF4y2Ba, 2006;Garcia-Ruiz等gydF4y2Ba．gydF4y2Ba, 2008). 微生物多样性和土壤功能性之间有着密切的关系，因为微生物介导了土壤的大部分过程。评估微生物多样性依赖于培养的技术似乎有偏差，因为只有1-4%的微生物可以在体外培养。文化无关技术的引入，如RISAgydF4y2Ba（gydF4y2BaPatreze等gydF4y2Ba．gydF4y2Ba,2009年gydF4y2Ba）gydF4y2BaAcosta-Martínez等gydF4y2Ba．gydF4y2Ba, 2007;坎贝尔等gydF4y2Ba．gydF4y2BaT-RFLP (Yi et al.， 2009;王等人gydF4y2Ba．gydF4y2Ba，2012），RAPD（Baymiev等人gydF4y2Ba．gydF4y2Ba, 1999;杨等人gydF4y2Ba．gydF4y2Ba, 2000;Sharma等gydF4y2Ba．gydF4y2Ba(2008)非常有助于了解土壤的遗传组成。随机扩增多态性DNA (RAPD)已广泛应用于植物(Elmeer et al.， 2009)、动物(steniak et al.， 2002)和微生物(Araujo et al.， 2004)的物种分类和系统发育分析。RAPD分析是比较土地利用系统的一项非常有用的技术，因为它可以说明由于环境或人类活动的变化，相似类型的土壤的遗传组成或结构的差异。gydF4y2Ba

关于印度喜马拉雅地区土地利用系统对微生物生化指标的影响的文献有限(Ghosh和Dhyani, 2005;贾斯汀等gydF4y2Ba．gydF4y2Ba, 2012)。本研究的目的是研究不同土地类型不同土壤类型对喜马拉雅地区西北地区土壤微生物土壤酶和遗传指纹的影响。在土壤酶，微生物生物量碳和RAPD标志物中产生的信息有助于评估不同土地利用系统对土壤生物健康的影响。gydF4y2Ba

材料和方法gydF4y2Ba

研究网站gydF4y2Ba

位于印度北阿坎德邦阿尔莫拉地区的9个土地使用系统被选为研究对象。其中，有四种完全不同的管理实践体系(有机耕作、大豆-小麦、玉米-小麦、饲料作物)位于Hawalbagh (29gydF4y2Ba^°gydF4y2Ba36、79镑gydF4y2Ba^°gydF4y2Ba40'E，平均海平面1250米)的Vivekananda山地农业研究所，Almora和Someshwar山谷的旱稻，距离农场25公里。林地利用系统代表Binsar野生动物保护区(29º37′N和79º20′E)的未受干扰的橡树(2400 amsl)和松树(1800 amsl)森林和Jageshwar(29.65°N 79.58°E)的雪松林。样品位置及一些理化特性详见表1。gydF4y2Ba

表1:位置、植被和土壤gydF4y2Ba 不同土地利用系统的性质。gydF4y2Ba 每个值是两个分析的平均值gydF4y2Ba 单击此处查看表格gydF4y2Ba

土壤和天气特征gydF4y2Ba

这些土壤的母体材料由云母，弹簧，板岩，砂石和钙缺乏花岗岩和塞锡岩石组成（Singh等人gydF4y2Ba．gydF4y2Ba2000)。遗传上，这些土壤属于气候成因灰化灰褐色森林土壤。除农田土壤为微酸性外，其余各体系均发生酸性土壤反应。气候属亚温带，除西南季风季节(6 - 9月)外，夏季温和(5 - 6月)，冬季极端(12 - 1月)，一般干燥。2012年7月采样期间，气温最高为30.1°C，最低为20.9°C，平均降雨量为137.5 mm。gydF4y2Ba

土壤采样gydF4y2Ba

从2012年7月收集来自0-15cm深度的每个部位的三种复合土壤样品。对于制作一个复合样品，将五个土壤核心混合。像其他工人一样（Patra等gydF4y2Ba．gydF4y2Ba2006)采用伪重复抽样方法。田间湿土样品保存在冰箱中，温度小于4℃gydF4y2Ba^ogydF4y2BaC用于保存酶活性直到分析结束。所有化学结果均为重复分析的平均值，并在烘箱干燥基础上表示。105℃干燥24 h后测定土壤湿度。gydF4y2Ba

土壤酶活性gydF4y2Ba
脱氢酶gydF4y2Ba

采用Klein et al.(1985)的方法，将0.2 ml 3%三苯四唑氯化铵(TTC)溶液和0.5 ml 1%葡萄糖混合至1克土壤样品，测定土壤脱氢酶活性。样品在28℃孵育gydF4y2Ba^ogydF4y2Ba再加入10ml甲醇于28℃再次孵育gydF4y2Ba^ogydF4y2BaC 8小时。用485nm吸光度法测定三苯基甲酰胺(TPF)的提取率。gydF4y2Ba

酸性和碱性磷酸酶gydF4y2Ba

用Tabatabai和Bremner(1969)所描述的方法量热估算酸性和碱性磷酸酶活性。对于每种土壤，在50ml锥形烧瓶中取样两组1gm (2mm筛过)土壤。在这两组中，一组作为对照。0.2 mL甲苯和4 mL pH为6.5(酸性磷酸酶)和pH为11(碱性磷酸酶)的改良通用缓冲液(MUB)加入到所有瓶中。gydF4y2BapgydF4y2Ba-硝基苯基磷酸盐(0.025 M)作为底物，在37℃孵育gydF4y2Ba^ogydF4y2BaC一个小时。孵育后，取1 ml 0.5M CaClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba加入4 ml 0.5M NaOH，旋转几秒钟。在440nm(蓝色滤光片)波长下用分光光度法测定滤液的黄色色强。大量的gydF4y2BapgydF4y2Ba根据所绘制的标准曲线计算每个样品中形成的-硝基酚。酸性磷酸酶活性以μ g表示gydF4y2BapgydF4y2Ba-硝基酚的释放量gydF4y2Ba

硝酸还原酶gydF4y2Ba

土壤硝酸盐还原酶测定5ml 0.1 M KNOgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba溶液加到5 g土壤中，在28℃下孵育24 h，添加NOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba ^{- - - - - -gydF4y2Ba}根据Roberg（1978）估计成立gydF4y2Ba

芳基硫酸酯酶gydF4y2Ba

使用Tabatabai和Bremner（1970）描述的方法热分估芳基硫酸酶活性。对于每种土壤样品，在50ml锥形烧瓶中取出两组1GM（2mM筛分）土壤。在这两组中，一组作为对照。将甲苯0.25ml和4ml 4ml乙酸盐缓冲液加入到所有烧瓶中。gydF4y2BapgydF4y2Ba-硝基苯基硫酸酯(0.025M)加入到样品中作为底物，在37℃孵育gydF4y2Ba^ogydF4y2BaC一个小时。孵育后，取1 ml 0.5M CaClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba加入4 ml 0.5 M NaOH。另外，1毫升的gydF4y2BapgydF4y2Ba- 将硝基苯基（0.025米）加入到剩余的样品中（对照）。在440nm(蓝色滤光片)波长下用分光光度法测定滤液的黄色色强。大量的gydF4y2BapgydF4y2Ba根据所绘制的标准曲线计算每个样品中形成的-硝基酚。芳基硫酸酯酶活性以µg表示gydF4y2BapgydF4y2Ba-硝基酚的释放量gydF4y2Ba

植酸酶gydF4y2Ba

用Ames(1966)的方法测定植酸酶活性。将一克筛过的土壤放入容量为15ml的螺旋盖试管中。在样品中，加入100 M醋酸钠缓冲液(pH 4.5)和1 ml植酸钠(1 mM)，在37℃下孵育1 hgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba羧基)。采用Jackson(1973)描述的氯亚锡还原磷钼蓝染色法，在10,000 rpm离心10分钟后去除三羧酸沉淀的蛋白质，并分析上清液中游离的无机磷。植酸酶活性的一个单位定义为在37℃下每分钟释放1m mol Pi的酶的量。gydF4y2Ba

土壤随机扩增多态性DNA分析gydF4y2Ba
微生物群落DNA提取gydF4y2Ba

根据制造指令，使用电力土壤DNA隔离套件（Mo Bio Laboratories Inc.）提取DNA。将土壤DNA装载在1％琼脂糖凝胶上，在水平电泳单元（BiORAD）中在80V下运行1小时，以80V，以检查纯度，并通过NanoDrop定量。gydF4y2Ba

聚合酶链反应(PCR)扩增gydF4y2Ba

PCR反应混合物(25µl)包含2.5µl 10×稀释缓冲液10pmol/反应随机引物，每个dNTP 200µM, 1.0 U PR DNA聚合酶(Bangalore Genei, India)， 100 ng纯化土壤DNA。在热循环器(Biorad)中进行扩增，先在94°C热启动5分钟，然后在94°C热启动1分钟，37°C热启动1分钟，72°C热启动2分钟，最后在72°C热启动7分钟。扩增产物在含0.5ug/ml溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶中分离，在80 V下冷却3小时。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

采用spss16软件进行双向方差分析(ANOVA)和邓肯多重范围检验(DMRT)进行均数比较。除另有说明外，结果中所涉及的显著性水平P < 0.05。采用单因素方差分析(PCA)进行均值分析，采用Wards方法进行分层培养。x统计软件。利用Total Lab 100软件(Clara Vision, France)将RAPD扩增片段转化为二进制字符矩阵“1”表示条带存在，“0”表示条带不存在。二进制字符矩阵由NTSYS-pc版本2.02计算机程序组装(Rohlf, 2001)。采用带算术平均的非加权对组法(UPGMA- Tree construction method)构造树状图。利用雅卡德相似系数，从定性数据矩阵中计算出成对关联系数。gydF4y2Ba

图1:gydF4y2Ba九种不同土地用途的排序gydF4y2Ba 系统土壤位点的作用有三种gydF4y2Ba 在PC1和定义的空间中复制gydF4y2Ba PC2轴的主成分分析进行与gydF4y2Ba 土壤酶（脱氢酶，酸性磷酸酶，gydF4y2Ba 碱性磷酸酶，硝酸还原酶，芳基gydF4y2Ba sulphatase和植酸酶)。组件1和2gydF4y2Ba 代表81.8和9.5％的变异gydF4y2Ba 分别的数据。gydF4y2Ba 点击这里查看图gydF4y2Ba

结果和讨论gydF4y2Ba

土壤酶gydF4y2Ba

脱氢酶活性在甘草林土壤中最高，而饲料作物和苹果种植区显著较低(表2)。与长期使用无机肥料的农场相反，有机农场表现出较高的DHA活性(11.6µg TPF g)gydF4y2Ba^-1gydF4y2Ba土壤hgydF4y2Ba^-1gydF4y2Ba）.农业生态系统在一种方式的平均年平均发现比森林生态系统少36.54%的DHA活动。脱氢酶涉及氧代谢的电子传递系统，需要细胞内环境来表达其活性，因此被认为是微生物整体功能的有效指标(Samuel, 2010;Abellan等gydF4y2Ba．gydF4y2Ba, 2011;gydF4y2BaDefrieri等人gydF4y2Ba．gydF4y2Ba, 2011)。我们的研究结果与Pandey et al.(2005)、Kang et al.(2009)、Abellan et al.(2011)对森林土壤的研究结果一致，与Gaind and Nain(2011)、Maurya et al.(2011)对农业土壤的研究结果一致，与Styla and Sawicka(2009)对兰花土壤的研究结果一致。林地土壤的DHA活性显著高于耕地。一般来说，由于有规律的凋落物可用性和随后的分解，森林系统含有较高的有机质。土壤有机质影响土壤生化、化学、生物和物理性质，控制土壤微生物活性(Dou等gydF4y2Ba．gydF4y2Ba，2007）。使用长期肥料使用的栽培系统显着影响土壤脱氢酶活性（Doran等gydF4y2Ba．gydF4y2Ba, 1987)。高剂量或重复使用肥料可能会限制微生物的生长，从而降低土壤中脱氢酶的活性(Kozanecka等gydF4y2Ba．gydF4y2Ba, 1996; 库查尔斯基等人gydF4y2Ba．gydF4y2Ba, 1996)。在我们的研究中，有机农场土壤的脱氢酶活性比其他农业管理措施土壤高40.5%，这与García-Ruiz等(2008)的结果相似，表明有机耕作对土壤脱氢酶的积极影响。gydF4y2Ba

表2：gydF4y2Ba土地利用制度对脱氢酶(DHA- g - TPF g)的影响gydF4y2Ba-1gydF4y2Ba土壤hgydF4y2Ba-1gydF4y2Ba)、酸性磷酸酶(AcP-µg PNP g .gydF4y2Ba-1gydF4y2Ba土壤hgydF4y2Ba-1gydF4y2Ba碱性磷酸酶(AlkP-µg PNP g .gydF4y2Ba-1gydF4y2Ba土壤hgydF4y2Ba-1gydF4y2Ba)，硝酸还原酶（NR mg kggydF4y2Ba-1gydF4y2Ba)，芳基硫酸酯酶(gydF4y2BaAryl-S - μ ggydF4y2Ba-1gydF4y2Ba土壤hgydF4y2Ba-1gydF4y2Ba)、植酸酶(Phyt- μg P .gydF4y2Ba我gydF4y2BaggydF4y2Ba-1gydF4y2BahgydF4y2Ba-1gydF4y2Ba）gydF4y2Ba和微生物生物量碳（MBC-Mg kggydF4y2Ba-1gydF4y2Ba在不同的土地利用系统下，喜马拉雅山中部不同深度的土壤有机质含量不同。gydF4y2Ba采用DMRT (Duncan’s Multiple Range Test)对均值进行分离，结果显示，不同字母后的均值差异显著，p<0.05。gydF4y2Ba 单击此处查看表格gydF4y2Ba

未扰动杉木林(914.4µg PNP g)的酸性磷酸酶活性也较高gydF4y2Ba^-1gydF4y2Ba土壤hgydF4y2Ba^-1gydF4y2Ba)，其次为栎林(635.9µg PNP g .gydF4y2Ba^-1gydF4y2Ba土壤hgydF4y2Ba^-1gydF4y2Ba）.相比之下，耕作土壤酸性磷酸酶活性较低:饲料<大豆-小麦>旱稻<苹果种植<玉米-小麦>有机农场。碱性磷酸酶在不同土地利用制度下也存在显著差异(p < 0.05)。碱性磷酸酶活性以栎林最高(315.4µg PNP g)gydF4y2Ba^-1gydF4y2Ba土壤hgydF4y2Ba^-1gydF4y2Ba)，其次为杉木林(252.4µg PNP g .gydF4y2Ba^-1gydF4y2Ba土壤hgydF4y2Ba^-1gydF4y2Ba）.苹果人工林土壤中碱性磷酸酶(42.6µg PNP g)显著降低gydF4y2Ba^-1gydF4y2Ba土壤hgydF4y2Ba^-1gydF4y2Ba)比酸性磷酸酶(295µg PNP g .)多gydF4y2Ba^-1gydF4y2Ba土壤hgydF4y2Ba^-1gydF4y2Ba）值。碱性磷酸酶的平均平均值比天然林系统栽培的土地较小42.2％。与其他长期无机肥料保持土壤相比，酸和碱性磷酸酶活性分别为31.8％和42.3％，较高42.3％。与森林土壤相比，我们的研究中发现培养土中酸性磷酸酶的较低值与Acosta-Martä±Nez等人一致gydF4y2Ba．gydF4y2Ba（2007）和Shi等人gydF4y2Ba．gydF4y2Ba(2008)。酸性磷酸酶是调节土壤中磷有效性的酶之一，植物根系是酸性磷酸酶的主要生产者(Speir and Cowling, 1991)。研究土壤的酸性是导致酸性磷酸酶高于碱性磷酸酶的原因，因为磷酸单酯酶是pH敏感酶，对土壤pH最敏感(Lemanowicz, 2011)。酸性土壤中酸性磷酸酶的较高值在其他地方也有报道(Dick等)gydF4y2Ba．gydF4y2Ba, 2000;王等人gydF4y2Ba．gydF4y2Ba, 2012)。长期使用的栽培生态系统中酸性磷酸盐含量越低，有机磷的矿化潜力越小，黄等(2011)的研究支持了这一观点。gydF4y2Ba我们对碱性磷酸酶的结果达成一致gydF4y2BaConn和Dighton(2000)和Ushio等人(2010)显示出积极的gydF4y2Ba凋落物质量对磷酸酶活性的影响，森林土壤的碱性磷酸酶活性高于农业土壤gydF4y2Ba系统。gydF4y2Ba苹果种植园和饲料作物土壤显示碱性磷酸酶的较小值，表明土壤中的较小微生物活性，因为微生物是土壤中碱性磷酸酶的主要来源（Aseri等人gydF4y2Ba．gydF4y2Ba, 2009).gydF4y2Ba

有机农场(1.98 mg kg)硝酸盐还原酶活性显著(p < 0.05)高于有机农场(1.98 mg kg)gydF4y2Ba^-1gydF4y2Ba)和玉米小麦栽培体系(1.83 mg kggydF4y2Ba^-1gydF4y2Ba）.有机农业对松木层状FYM进行定期修整，这可能影响了异化氮的减少过程(Tiedje等人)gydF4y2Ba．gydF4y2Ba, 1982)。在Ramana等人的早期研究中，硝酸盐还原酶活性是土壤养分状况改变的有效指标gydF4y2Ba．gydF4y2Ba(2008)和Poobathiraj等人gydF4y2Ba．gydF4y2Ba(2012)．由于凋落物的不断减少，森林土壤处于厌氧状态，硝酸盐还原酶活性增强(Rutting et al .)gydF4y2Ba．gydF4y2Ba, 2011)。在我们的研究中，森林土壤的硝酸盐还原酶活性高于有机农场和玉米小麦农场。关于pH、土壤有机质、水分和土壤氮对硝酸盐还原酶活性的影响已有许多研究报道(Gamble et al .)gydF4y2Ba．gydF4y2Ba, 1977; 戴维森和斯塔尔，2000年；帕特拉等人gydF4y2Ba．gydF4y2Ba，2006）。然而，文献中没有足够的数据可以综合分析土地利用对硝酸硝酸盐还原酶活性的影响。gydF4y2Ba

平均芳基硫酸酶活性范围为11.57μgpnp ggydF4y2Ba^-1gydF4y2Ba人力资源gydF4y2Ba^-1gydF4y2Ba在苹果种植园土壤中至222.78μgpnp ggydF4y2Ba^-1gydF4y2Ba人力资源gydF4y2Ba^-1gydF4y2Ba以橡树林土壤为例。除橡树和除草土壤外，其他生态系统土壤芳基磺酸酶活性均显著降低，依次为旱稻>玉米-小麦农场>有机农场≈大豆-小麦农场≈松林≈饲料作物>苹果种植园农场。硫的矿化是通过土壤芳基硫酸盐酶进行的(Tabatabai, 1994)，它催化酯硫酸盐键的水解。芳基硫酸酯酶对土壤特性和管理措施高度敏感，Bandick et al.， 1999, Dick et al.， 1988, Frankenberger and Dick, 1983。据Arunkumar et al. 2013报道，森林通常含有较高的真菌生物量，在酸性土壤反应下，芳基硫酸盐酶活性增强，因为它与麦芽糖醇(Balota et al.， 2004)密切相关，而麦芽糖醇几乎只存在于真菌中(Newell et al.， 1987)。同样，在本研究中，与其他耕地相比，栎林和雪松林土壤中芳基硫酸酯酶的含量显著较高。gydF4y2Ba

植酸酶的平均活性为0.84 μg Pi ggydF4y2Ba^-1gydF4y2BahgydF4y2Ba^-1gydF4y2Ba为2.58 μg Pi ggydF4y2Ba^-1gydF4y2BahgydF4y2Ba^-1gydF4y2Ba以橡树林为例。肌醇磷酸酶(土壤植酸)是土壤中有机磷的储存库(Rodríguez和Fraga, 1999)，并被微生物植酸酶水解(Menezes-Blackburnace et al.， 2013)。土壤植酸酶能有效催化植酸和磷酸化化合物释放磷酸盐(Kumar et al.， 2013)。有机养殖的植酸酶活性较高(2.03 μg Pi g)gydF4y2Ba^-1gydF4y2BahgydF4y2Ba^-1gydF4y2Ba)，表明与无机肥料相比，有机肥料具有更好的磷循环能力。gydF4y2Ba

主成分分析，线性回归和层次聚类gydF4y2Ba

通过RAPD对土壤酶的主成分分析和多态性条带数的分析表明，九个不同的土地利用系统存在分离现象。第一主成分轴（PC1）解释了81.8%的数据方差，而第二主成分轴（PC2）解释了9.5%的数据方差（图3）。除玉米-小麦和有机耕作区土壤外，其他耕作生态系统土壤（大豆-小麦、旱稻、饲料、苹果系统）隔离在PCA区的左侧，而橡树和deodar森林系统土壤隔离在该区的右下方。PC1的正负荷得分最高的是deodar土壤（3.48），其次是deodar土壤（3.34）、有机农场土壤（1）和玉米-小麦土壤（0.22）。我们的结果与Silva et al.2012的结论一致，即主成分分析可以区分农业土壤和森林土壤的生物特性。在Gonnety et al.（2012）的一项类似研究中，根据PCA图上的酶分析对不同的土地利用系统进行了聚类，他们的研究还建议使用土壤酶监测土壤质量。线性回归图显示了土壤酶与微生物生物量碳之间的正相关性和显著相关性，表明这些酶作为土壤质量生态指标的敏感性（图2）。这些数据与Moscatelli等人（2005年）的观点一致，即土壤生物和生化指标，如土壤酶，当与其原始碳源（即微生物生物量碳）相连时，可以作为检测土壤质量恶化的有效指标。土壤脱氢酶活性与微生物生物量碳高度相关（Y=0.022x–4.429，rgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba= 0.824, P < 0.05, n = 9×3=27)。通过沃德的分层聚类方法对不同土地利用系统的土壤酶进行聚类，将土地利用系统分为两大类。雪松林、栎林和有机农田土壤属于一个主要类群，而松林和所有其他耕地土壤属于另一个主要类群。我们的研究结果与Masto等人2012年的研究结果一致，即土壤酶是高度敏感的，能够将不同土地利用方式或处理方式的土壤质量聚类。gydF4y2Ba

图2:A, B, C, DgydF4y2Ba 点击这里查看图gydF4y2Ba

图2:E，FgydF4y2Ba 点击这里查看图gydF4y2Ba

图3：OPG-2（A），OPG-11（B），OPG-12（C），OPG-12（C）和OPG 14（D）产生的不同土地使用系统的RAPD-PCR产物，用于不同的土地使用系统。Lane M-9：gydF4y2Ba100bp尺、德奥达林、橡树林、松林、饲料农场、苹果种植园、玉米小麦农场、大豆小麦农场、有机农场、旱稻农场。gydF4y2Ba 点击这里查看图gydF4y2Ba

土壤随机扩增多态性DNA分析gydF4y2Ba

RAPD分析显示，样品间多态性较高。本研究利用8条引物对土壤微生物DNA图谱进行分析，其中4条产生了明确的条带(表4)，共扩增出148条条带，其中65条条带具有多态性(56%)。图2为OPG-2、OPG-11、OPG-12和OPG-14引物对不同土地利用制度下土壤的放大曲线。利用宏基因组DNA的多态性，采用算术平均的非加权对分组法对土地利用系统进行聚类。聚类分析得到了一个有四个主要聚类的树状图(图3)。聚类I包括橡树林土壤和有机农业。松林和饲料归为第二组。类群III包括桉树林和大豆-小麦，类群IV包括玉米-小麦和旱稻。通过观察树状图可以看出，橡树林和有机耕作(0.258)的样本在遗传上更接近，而苹果种植园的样本与其他样本的相似性很小。子cluster - 2上的客户包括样品的松树林和饲料(0.192)彼此密切相关,subcluster-3由喜马拉雅雪杉林和soybean-wheat(0.139)显示更多的彼此相似,而subcluster-4由样品的粉和旱稻(0.172)显示彼此更相似。利用距离矩阵计算样本间的相似度。 The genetic similarity based on RAPD has been presented in form of Jaccard similarity coefficient in Table 3. The average Jaccard similarity obtained was 0.105 with the range of 0.01-0.258. Very less values of similarity index indicate that these ecosystems have very high diverse microhabitats and microbial community structure in this region. Similarity index suggest that the studies land use systems have high variation in genetic composition with the average genetic similarity of 0.128. RAPD is cost effective and rapid technique to study the soil microbial communities and to understand the linkage between soil micro flora community structure and soil physio-chemical characteristics (Yang et al．gydF4y2Ba, 2000;德克斯特等gydF4y2Ba．gydF4y2Ba, 2010). 栎林和有机农田土壤聚为一组，表明它们之间的遗传组成相似，表明长期有机耕作可以改善土壤质量。例如，Reganold等人（2010年）的一项类似研究通过使用微阵列技术的土壤DNA证明，有机耕作土壤比传统耕作土壤具有更高的微生物多样性。农药和化肥的使用对土壤微生物群落的DNA序列多样性有负面影响。我们的结果与Yang等人的结果一致gydF4y2Ba．gydF4y2Ba(2000)，与未受干扰的森林生态系统相比，在频繁使用农业化学物质的农业生态系统中观察到的多态带较少。gydF4y2Ba

图4:树状图(UPGMA)基于gydF4y2Ba 数据来自Jaccard相似度RandomgydF4y2Ba 扩增多态性DNA分析。gydF4y2Ba1 - 9: -gydF4y2Ba 雪松林，橡树林，松林，gydF4y2Ba 饲料农场、苹果种植园、玉米小麦gydF4y2Ba 农场，大豆小麦农场，有机农场gydF4y2Ba 还有旱稻农场。gydF4y2Ba 点击这里查看图gydF4y2Ba

表3:基于RAPD-PCR树构建法的距离相似矩阵-不加权对组法加算术平均数- UPGMA(随机扩增多态性DNA-RAPD)gydF4y2Ba 单击此处查看表格gydF4y2Ba

表4:名称和随机引物gydF4y2Ba 序列用于本研究gydF4y2Ba 单击此处查看表格gydF4y2Ba

研究表明，土地利用和种植历史的变化对土壤生化指标有强烈的影响。结果表明，RAPD标记与土壤生化指标相结合可以有效地反映土壤生物健康状况。森林生态系统土壤各参数值均最高，耕作系统土壤酶值较低。与长期使用农用化学品可能对土壤健康造成不利条件的耕地土壤相比，森林土壤中凋落叶的大量沉积和没有人为干扰可能是这种观察的主要原因。RAPD分析结果显示，样本间多态性较高，可作为土地利用格局变化的有效指标。还需要进一步的研究来确定不同土壤的基因组成差异，这将使我们对真正意义上的可持续农业有更多的了解。gydF4y2Ba

图5：九种不同土地利用的密度分布图gydF4y2Ba 基于沃德的土壤酶系统gydF4y2Ba 层次聚类方法gydF4y2Ba1 - 9: -喜马拉雅雪杉gydF4y2Ba 森林，栎林，松林，饲料农场，gydF4y2Ba 苹果种植园、玉米小麦农场、大豆-gydF4y2Ba 小麦农场、有机农场和旱稻农场。gydF4y2Ba 点击这里查看图gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

我们感谢新德里印度农业研究所主任、院长和联合主任(教育)以及印度政府科学技术部(DST)为开展这项工作提供必要的财政支持。gydF4y2Ba

参考文献gydF4y2Ba

1. Abellan M.A.，Baena C.W.，Morode F.a.g.，Picazo M.I.C，Perez D.C.和Lucas-Borja M.E.，gydF4y2Ba森林系统,gydF4y2Ba20,379-388（2011）。gydF4y2Ba
2. 阿科斯塔-马丁内斯V.，克鲁兹L.， Sotomayor-Ramírez L.和Pérez-Alegría.，gydF4y2Ba应用土壤生态学gydF4y2Ba35岁,35 - 45(2007)。gydF4y2Ba
3. Araújo w.l.，安吉利斯地检和阿泽维多j.l.，gydF4y2Ba巴西档案生物学技术gydF4y2Ba， 47,375 -380(2004)。gydF4y2Ba
4. Arunkumar K.， Singh r.d.， Patra A.K.和Sahu s.k.，gydF4y2Ba国际当代微生物学应用科学杂志gydF4y2Ba， 2,325 -338， (2013)gydF4y2Ba
5. 陈志强，陈志强，陈志强。酶学研究进展。gydF4y2Ba
6. 阿塞里·G.K.，杰恩·N。和Tarafdar J.C。，gydF4y2Ba美国-欧亚农业与环境科学杂志gydF4y2Ba, 5,564-570 (2009).gydF4y2Ba
7. Balota e.l.， Kanashiro M.， Filho a.c.， Andrade D.S. and Dick r.p.，gydF4y2Ba巴西微生物学杂志gydF4y2Ba, 35300 - 306(2004)。gydF4y2Ba
8. Bandick A.K.和Dick R.P，gydF4y2Ba土壤生物学与生物化学gydF4y2Ba， 31, 1471-1479(1999)。gydF4y2Ba
9. 巴米耶夫·a·k，切梅里斯·a·v和瓦基托夫·v·a，gydF4y2Ba俄罗斯遗传学杂志gydF4y2Ba，35,1387-1393（1999）。gydF4y2Ba
10. 土壤中细胞外酶与底物的相互作用。见于:Slater, j.h.， Whittenbury, R.， Wimpenny, J.W.T. (Eds.)。自然环境中的微生物pp 249-298(1983)。gydF4y2Ba
11. 坎贝尔·j·h，克拉克·j·s和扎克·j·c，gydF4y2Ba微生物生态学gydF4y2Ba, 57261 - 266(2009)。gydF4y2Ba
12. Conn C，和deighton J，gydF4y2Ba土壤生物学与生物化学gydF4y2Ba， 32,489 -496(2000)。gydF4y2Ba
13. Davidson T.E.和Stahl M，gydF4y2Ba美国土壤科学学会学报gydF4y2Ba, 64,1129–1136 (2000).gydF4y2Ba
14. Defrieri r.l.， Sarti G.， Tortarolo m.f.， Escobar-Ortega J.， García de Salamone I.， D´Auria F. and Effron D.，gydF4y2Ba土壤与植物营养学报，gydF4y2Ba111 - 124(2011)。gydF4y2Ba
15. Dexter K.g.，Penningto T.D.和Cunningham C.W.，gydF4y2Ba生态专著gydF4y2Ba(2010)。gydF4y2Ba
16. 土壤健康的生物指标迪克R.P.CAB INTERINATIONAL，WALLINGFORD，PP 121-156（1997）。gydF4y2Ba
17. 迪克·r·p，拉斯穆森体育和科尔·e·a，gydF4y2Ba生物学、肥力和土壤gydF4y2Ba, 6159 - 164(1988)。gydF4y2Ba
18. 狄克·W.A.，程·L。王平。，gydF4y2Ba土壤生物学与生物化学gydF4y2Ba， 32, 1915-1919(2000)。gydF4y2Ba
19. 多兰成员j.w.。gydF4y2Ba肥力和土壤生物学gydF4y2Ba， 5,68 -75(1987)。gydF4y2Ba
20. 窦飞，赖特·A.L.和荣誉f.m.，gydF4y2Ba土壤与耕作研究gydF4y2Ba， 94, 530-536(2007)。gydF4y2Ba
21. 埃尔米尔·k·m，加拉格尔·t·f和亨纳蒂·m·j，gydF4y2Ba非洲生物技术》杂志gydF4y2Ba3219 - 3222 (2009)gydF4y2Ba
22. 弗兰肯伯格和迪克，gydF4y2Ba美国土壤科学学会学报，gydF4y2Ba47,945-951（1983）。gydF4y2Ba
23. Gaind S.，Nain L.，WorldgydF4y2Ba农业科学杂志gydF4y2Ba， 7,480 -488(2011)。gydF4y2Ba
24. Gamble T.N.，Betlach M.R.和Tiedje J.M。，gydF4y2Ba应用环境微生物学gydF4y2Ba, 33, 926–939 (1977).gydF4y2Ba
25. García-Ruiz R.， Ochoa V.， Hinojosa M.B.， carira J.A.，gydF4y2Ba土壤生物学与生物化学，gydF4y2Ba40,2137-2145（2008）。gydF4y2Ba
26. Ghosh p和Dhyani p，gydF4y2Ba热带生态gydF4y2Ba, 46岁,173 - 181(2005)。gydF4y2Ba
27. Gonnety j.t.， Assemien E.F.L, Guei a.m.， Dri A.A.， Djina Y.， Kone A.W. and Tondoh J.E.，gydF4y2Ba生物技术、农学、社会与环境，gydF4y2Ba16478 - 485(2012)。gydF4y2Ba
28. 黄玮，刘军，周刚，张东，邓强。gydF4y2Ba生物地球科学gydF4y2Ba, 8, 1901-1910 (2011).gydF4y2Ba
29. Justin G.K.，Singh R.D.，Patra A.K.和Arunkumar K。，gydF4y2Ba北欧农业学报，B辑-土壤与植物科学gydF4y2Ba、63、200 - 205(2012)。gydF4y2Ba
30. 姜赫，姜森，李丁，gydF4y2Ba生态研究gydF4y2Ba，24,1137-1143（2009）。gydF4y2Ba
31. Kibblewhite m.g.， Ritz k和Swift M.J.gydF4y2Ba英国皇家学会哲学汇刊B辑:生物科学gydF4y2Ba， 363, 685-701(2008)。gydF4y2Ba
32. Klein D.A.，Sorensen D.L.并减少e.f.，土壤填海工艺：微生物分析和应用。Marcel Dekker PP 141-171（1985）。gydF4y2Ba
33. 科尔特和格林伯格，gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba，441,300-302（2006）。gydF4y2Ba
34. Kozanecka T.，Rekosz-Burlaga H.和Russel S.，gydF4y2BaRoczn Glebozn,gydF4y2Ba47、75-84（波兰语）（1996年）。gydF4y2Ba
35. (ei) (ei) (ei) (ei) (ei)(1996)。gydF4y2Ba
36. Kumar D.，Rajesh S.，Balashanmugam P.，Rebecca L.J.和Kalaichelvan P.T.，gydF4y2Ba现代生物技术杂志gydF4y2Ba， 2,46 -52(2013)。gydF4y2Ba
37. Lemanowicz J。gydF4y2Ba波兰农学学杂志，gydF4y2Ba4、12 - 15(2011)。gydF4y2Ba
38. 马斯托·R.E.，阿希瓦尔·R.，乔治·J.，拉姆·L.C.和塞尔维·V.A。，gydF4y2Ba土壤科学学报，gydF4y2Ba1,8-15（2011）。gydF4y2Ba
39. Maurya B.R.，Singh V。和Dhyani P.P。，gydF4y2Ba国际土壤科学杂志gydF4y2Ba，6,238-248（2011）。gydF4y2Ba
40. Melero S, Porras J.C.R, Herencia J.F.和Madejon E，gydF4y2Ba土壤与耕作研究，gydF4y2Ba90年,162 - 170(2006)。gydF4y2Ba
41. Jorquera m.a.， Greiner R.， Gianfreda L.和Maria L. m .，gydF4y2Ba《环境科学与技术评论》，gydF4y2Ba43岁,916 - 954(2013)。gydF4y2Ba
42. Moscatelli m.c.， Lagomarsino A.， De Angelis P.和Grego S.，gydF4y2Ba应用土壤生态学gydF4y2Ba， 30, 162-173(2005)。gydF4y2Ba
43. Newell S.Y, Miller, J.D.和Fallon, r.d.，gydF4y2Ba体力学gydF4y2Ba, 79, 688-695 (1987).gydF4y2Ba
44. Pandey h.n.， Ralte V.， barrick S.K, Tripathi R.S. and Swapna D.P.，gydF4y2Ba生态学报gydF4y2Ba28, 163 - 172(2005)。gydF4y2Ba
45. Patra a.k.， Chhonkar P.K.和Khan m.a.，gydF4y2Ba欧洲土壤生物学杂志，gydF4y2Ba42岁,173 - 180(2006)。gydF4y2Ba
46. Patreze C.M, Paulo D, Martinelli a.p.， Cardoso E.J.B.和Tsai S.M，gydF4y2Ba共生gydF4y2Ba48岁,164 - 172(2009)。gydF4y2Ba
47. Poobathiraj K.， Palani N.和Ramesh a.c.，gydF4y2Ba生物科学研究杂志，gydF4y2Ba106 - 111(2012)。gydF4y2Ba
48. Ramesh P.， Panwar N.R.和Singh a.b.，gydF4y2Ba印度植物生理学杂志gydF4y2Ba， 13,2 -3(2008)。gydF4y2Ba
49. Reganold j.p.， Andrews p.k.， Reeve J.R, Carpenter-Boggs L.， Schadt C.W.， Alldredge J.R.， Ross CF .， Davies N.M.和Zhou J.，gydF4y2Ba《公共科学图书馆•综合》gydF4y2Ba5, e12346 doi: 10.1371 / journal.pone。0012346,(2010)。gydF4y2Ba
50. Roberg M.R.，土壤酶测量和提取方法，载：R.G.Burns（编辑），《土壤酶》，学术出版社，伦敦，第页。350 (1978).gydF4y2Ba
51. 马勒·C.和克莱梅特森·L.，gydF4y2BaBiogeosciences,gydF4y2Ba1779 - 1791(2011)。gydF4y2Ba
52. 公元撒母耳,gydF4y2Ba农业科学研究杂志，gydF4y2Ba42,306-310（2010）。gydF4y2Ba
53. 沙玛·N、桑德森·Y、沙玛·r和辛格·GgydF4y2Ba印度当前的科学gydF4y2Ba，94,1058-1061（2008）。gydF4y2Ba
54. 史志军，卢勇，徐志刚，付树林，gydF4y2Ba植物土壤环境gydF4y2Ba341 - 346(2008)。gydF4y2Ba
55. Silva C.F, Pereira M.G, Miguel D.L, Feitora J.C.F, Loss A, Menezes c.e. and Silva emr，gydF4y2Baresta Brasileira De Ciencia Do SologydF4y2Ba, 36, 1680-1689 (2012).gydF4y2Ba
56. Singh R.D.，Ghosh B.N.，Prakash V.，Bisht J.k.和古普塔H.S.，N-W Himalayas农业生产的土壤管理。vpkas。印度农业研究理事会PP 11（2000）。gydF4y2Ba
57. Sinsabaugh r.l.， Antibus R.K.和Linkins a.e.，gydF4y2Ba农业、生态系统和环境gydF4y2Ba，34,43-54（1991）。gydF4y2Ba
58. Speir T.W.和Cowling J.C。，gydF4y2Ba生物与肥沃土壤gydF4y2Ba， 12,189 -194(1991)。gydF4y2Ba
59. steniak E.， Zagalska M.和Oewitonski M.，gydF4y2Ba应用遗传学杂志gydF4y2Ba， 43,489 -499(2002)。gydF4y2Ba
60. Styla k和Sawicka A，gydF4y2Ba农学研究gydF4y2Ba, 7, 855-864 (2009).gydF4y2Ba
61. Tabatabai M.A.和Bremner j.m.，gydF4y2Ba土壤生物化学，gydF4y2Ba301 - 307(1969)。gydF4y2Ba
62. Tabatabai M.A.和Bremner j.m.，gydF4y2Ba美国土壤科学学会学报，gydF4y2Ba34,225-229（1970）。gydF4y2Ba
63. Tabatabai, M.A.土壤酶。《土壤分析方法》，SSSA书，第5辑。美国土壤科学学会，麦迪逊，威斯康星州页:775 - 883(1994)。gydF4y2Ba
64. Tiedje J.M.，Sexstone A.J.，MyRold D.D.和罗宾逊J.A.，gydF4y2Ba安东尼范LeeuwenhockgydF4y2Ba， 48569 -583(1982)。gydF4y2Ba
65. Ushio b.m.， KanehiroKitayama和Teri C.B.gydF4y2BaPedobiologiagydF4y2Ba53, 227 - 233(2010)。gydF4y2Ba
66. 王绍，冈萨雷斯·佩雷斯P.，叶杰。和黄德福,。，gydF4y2Ba世界微生物与生物技术杂志gydF4y2Ba, 28, 493-503 (2012).gydF4y2Ba
67. 杨永华，姚健，胡珊。gydF4y2BaMicrobiol生态gydF4y2Ba， 39, 72-79(2000)。gydF4y2Ba
68. 李赫，Kim H.J, Kim C.G, Harn C.H.， Kim H.M.， Park S.，gydF4y2Ba植物生物学杂志，gydF4y2Ba52, 577-584 (2009).gydF4y2Ba