当前的世界环境

介绍

在一个因科学发现和技术进步而使人们生活水平提高而眼花缭乱的世界里，这些发展的负面后果开始显现并成为人们关注的焦点。微生物在环境条件下通过不同的酶介导反应催化其代谢过程，并具有显著的特异性。酶替代苛刻的化学技术已经导致了对天然微生物生物多样性的深入探索，以发现酶可以有效地发挥作用，并在不久的将来产生无污染的“梦想技术”。斯里尼瓦桑(et al .,1999)。

我们生活在“细菌时代”(Gould, 1996)的“微生物星球”(Woese, 1999)。微生物是最早的细胞生命形式，在多细胞、宏观生命形式出现之前，微生物在地球上活跃了30亿年。在那段时间里，并一直延续到现在，通过一系列惊人的不同代谢和生理能力的发明，微生物进化到利用非生物世界所呈现的众多环境和微生境。迅速积累的证据表明，微生物最有可能构成地球上绝大多数的生物种类。微生物进行的代谢活动非常多样化，其中一些活动为其他生命形式的进化创造了条件。

已描述迄今为止估计170万种物种;目前地球上存在的物种总数的估计值范围从500万到近1亿。真菌是昆虫后世界上第二大生物生物群体。目前已知的真菌物种约为72,036种，在印度遇到了27,000个真菌（Manoharachary，2002）。

在印度记录的真菌数量超过27,000种，最大的生物群落在昆虫后记载（Sarbhoy出版社。, 1996)。真核生物界有4门103目484科4979属。真菌是真核生物大群中的一员，包括微生物如酵母和霉菌，以及我们更熟悉的蘑菇。真菌在有机物的分解和养分的循环交换中起着重要的作用。长期以来，它们一直被用作食物的直接来源，如蘑菇和松露，作为面包的发酵剂，并在各种食品的发酵中，如葡萄酒、啤酒和酱油。自20世纪40年代以来，真菌被用于生产抗生素，最近，真菌产生的各种酶被用于工业和洗涤剂。真菌也被用作生物制剂来控制杂草和害虫。许多物种产生被称为真菌毒素的生物活性化合物，如生物碱和聚酮，它们对包括人类在内的动物都是有毒的。它们的生长可能与它们在28°C下生长并产生蛋白质和脂肪水解酶的能力有关。土壤真菌的识别主要有两种方法;直接检查和培养分离。 The limitations of the first method are obvious, and although it has produced many excellent results, the physical barriers in the way of such a method limit its usefulness, and in most cases such observations as were made by it were confirmed by resort to cultural methods. In the second method, that of isolation of cultures, has been more widely used and has produced the greater numbers of species of recognized soil fungi. The substrate used in making the isolation is of prime importance in determining the species that will be taken cannot be denied. The remarkable discovery of Coker and his associates that many species of saprolegniales are seemingly present in a very wide range of soils and localities was the result of the application of the techniques and materials used to isolate this group of fungi from water samples.

图1 点击此处查看数字

生物多样性是指地球上生命的多样性，包括所有活着的动物、植物和微生物物种。Hawksworth(2002)认为真菌是生物多样性的主要组成部分，对其他生物的生存至关重要，在全球生态过程中起着至关重要的作用。真菌是普遍存在于各种生境中的生物，是适应性最强的生物。土壤是细菌、真菌、酵母菌、线虫等微生物的重要栖息地之一。丝状真菌是土壤生物量的主要贡献者(Alexander 1977)。它们是主要负责有机物分解的有机营养生物。它们的活性参与了土壤中有毒物质的生物退化和生物降解(Rangaswami)et al .,1999)。已经发现土壤中存在更多数量的Fungi，而不是任何其他环境（Nagmaniet al .,2005)。真菌在土壤形成、土壤肥力、土壤结构和土壤改良中发挥着重要的作用，有助于生态系统的养分循环和维持et al .,2008）.真菌在生态系统的结构和功能中占有非常重要的地位。它们分解腐殖质中的有机物，释放养分，吸收土壤碳，固定有机养分。深入研究土壤微生物的丰度和多样性可以揭示它们在生态系统养分循环中的作用。

材料和方法

样本地点的选择

在卢迪亚纳及其附近的各个村庄中选择了14个不同的地点，如表1所示(见补充表)。

土壤样品采集

收集了不同类型的土壤样品，即废土(W)、倾倒土(D)、凋落叶(L)、分解有机肥(M)等。样品(500克)悬浮在无菌塑料袋中，彻底包装，保存于4ËšC。

图2 点击此处查看数字

隔离的真菌

样品保存在4ËšC冰箱中，直到真菌分离。分离真菌时，在PDA培养基(包含微生物生长所需的所有营养物质的溶液)中加入50 g/ml四环素以抑制细菌，并置于分离板中。添加各种化学成分的培养基接种并在28ËšC孵育。

媒体（G / L）

• 土豆（去皮） - 200
• 葡萄糖- 10
• agar - 15.
• pH - 5.6
• 蒸馏水 - 1000毫升

纯化真菌菌株

在4天后孵育真菌菌落开始出现在PDA培养基上分离出来，在28℃下进一步温育4天。无菌地拾取纯化的菌落并转移至PDA倾斜。将倾斜在28℃温育4-5天，以进行最高生长。然后将倾斜在冰箱中储存在4℃。

表1:样本点的选择

美国没有。	网站的名称	网站代码
1	斯德。KoharaTeh: Distt卢迪亚纳	KO
2	斯德。JandialiTeh: Distt卢迪亚纳	晶澳
3.	斯德。ramgarhteh：distt ludhiana	ra.
4.	斯德。TajpurTeh: Distt卢迪亚纳	TA.
5.	斯德。Suneetteh：Destt Ludhiana	苏
6.	斯德。LaltoTeh: Distt卢迪亚纳	拉
7.	斯德。JhabewalTeh: Distt卢迪亚纳	JH
8.	斯德。Ayalikhurdteh：Destt Ludhiana	法国航空
9.	斯德。Ayali Kalanteh：Destt Ludhiana	又名
10.	斯德。Mundiankhurdteh：Destt Ludhiana	MKH.
11.	斯德。Mundian KalanTeh:卢迪亚纳区	MKA.
12.	斯德。MangliucchiTeh: Distt卢迪亚纳	民大
13.	斯德。Bastijhodewalteh：Destt Ludhiana	BJO
14.	斯德。Sunder nagarTeh:卢迪亚纳区	苏

纯培养的维护

将样品储存在（4℃）的冰箱中以鉴定真菌。

理化分析 pH对真菌殖民生长的影响

真菌样品在不同pH范围(3、7和9)下生长，以检查pH对其生长的影响。在不同的时间间隔测量真菌菌落直径(mm)。

温度对菌落生长的影响

真菌样本在不同的温度范围内生长(25ËšC, 35ËšC, 45ËšC)，以检查温度对其生长的影响。

样品的生化筛选 淀粉酶测定

根据BEPL的方法进行筛选et al .,(2006)和Rele(2004)。在含1%可溶性淀粉培养皿上的琼脂培养基上进行真菌培养酶活性的筛选。在培养基凝固后，用软木钻孔机在无菌条件下挖出10毫米左右的孔。将酶粗提物填入井中，直立放置于28ËšC培养96小时。平板被革兰氏碘溶液淹没，观察井周围清晰的区域。添加热变性粗酶样品保持阴性对照。变性是通过在110ËšC煮沸酶提取物20分钟，然后突然在冰浴中冷却5分钟。用克氏碘溶液浸泡后，生长线周围的清晰区域表明淀粉水解

纤维素酶测定

筛查按照Waksman和Fred(1922)的方法进行。在czapekdox琼脂培养基培养皿上筛选真菌培养的酶活性。在培养基凝固后，用软木钻孔机在无菌条件下挖出10毫米左右的孔。将酶粗提物填入井中，直立放置于28ËšC培养96小时。用0.1%的刚果红溶液浸透平板，观察井周围清晰的区域。添加热变性粗酶样品保持阴性对照。将酶提取物在110ËšC中煮沸20分钟，然后在冰浴中突然冷却5分钟进行变性。用0.1%刚果红染料溶液浸透后，在生长线周围有一个清晰的区域表明淀粉水解。

表2：不同pH范围的效果范围对真菌SP的生长。

时间	Aspergillusglaucus			Aspergillusfumigatus			镰刀菌素sp
	pH值,			pH值,			pH值,
	pH-3	pH-7	pH-9	pH-3	pH-7	pH-9	pH-3	pH-7	pH-9
24小时	0.	2	2	0.	1．5	0.5	0.	2．5	2．5
48小时	0.	3．5	3.	0.	2．5	2．5	0.	3．5	5．8
72小时	0.5	4．8	7.5	0.	4．5	4．5	0.	4．8	7.
96小时	1	9.5	10.5	0.	11.5	6.5	1．5	9.	8.5
时间	镰刀菌素sp。			Aspergillusnidulans			镰刀菌素sp
	ph			ph			ph
	pH-3	pH-7	pH-9	pH-3	pH-7	pH-9	pH-3	pH-7	pH-9
24小时	0.	0.	1．5	0.	2	2．5	0.	2．5	2．5
48小时	0.	0.	3.	0.	2．8	5．5	0.	3．5	5．8
72小时	0.	2	5.	0.8	6.	6.5	0.	4．8	7.
96小时	2．5	3．5	7.5	2	9.5	8.	1．5	9.	8.5
时间	镰刀菌素sp。			aspergillusflavus.			aspergillusniger.
	pH值,			pH值,			pH值,
	pH-3	pH-7	pH-9	pH-3	pH-7	pH-9	pH-3	pH-7	pH-9
24小时	0.	0.	1．5	0.	1．5	0.5	0.	2	1
48小时	0.	0.	3.	0.	3.	3.	0.	2．8	2．5
72小时	0.	2	5.	1．5	7.5	7.5	0.	6.	4.
96小时	2．5	3．5	7.5	1．8	10.5	11.	0.5	11.	7.

蛋白酶测定

通过将脱脂乳培养基上产生的真菌培养在PDA培养基上培养筛选，最后转移至PDA倾斜并保持在4℃。使用真菌选择性培养基（PDA：马铃薯葡萄糖琼脂，麦芽提取物，Czapek和Dox培养基）筛选蛋白酶，含有两种不同的蛋白质底物，大豆（20g / L）和酪蛋白蛋白胨（10g / L）。加入这些成分以诱导真菌的蛋白酶合成，并在24小时后测量生长，48小时，72小时和96Hrs。

识别的文化

通过研究培养物的宏观外观、色素沉着和生长速率来鉴定培养物(见附页表5)。对菌丝的颜色、质地、宏观结构、生长区域、空中菌丝和水下菌丝及菌落形态等重要性状进行了目测研究。乳酚棉蓝染色后，观察玻片培养进行镜检。基于这些特征进行识别，采用Gilman 's Manual for Fungus identification (Gilman J.C 1995)。

淀粉酶纯化菌株的筛选纯化真菌菌株的纤维素酶筛选纯化真菌菌株的蛋白酶筛选 点击此处查看数字

结果

纯化真菌菌株的物理化学表征

pH对真菌菌落生长的影响

真菌样品在不同pH范围(3、7和9)下生长，以检查pH对其生长的影响。在不同的时间间隔测量真菌菌落（mm）的直径。

pH是氢离子浓度往复对数的符号（Log / H.⁺)以克原子每升为单位。溶液的相对酸度或碱度的量度称为pH值。

pH是确定微生物的生长和形态的重要因素之一，因为它们对培养基中存在的氢离子的浓度敏感。每个生物体系统具有特定的pH范围，其可以起作用。pH值还用作酶合成的起始和结束的有价值指标（Friedrichet al .,1989)。

温度对菌落生长的影响

真菌样本在不同的温度范围内生长(25ËšC, 35ËšC, 45ËšC)，以检查温度对其生长的影响。在不同的时间间隔测量真菌菌落（mm）的直径。

温度是控制酶活性的重要生物化学因素。选择乳粳菌株进行温度表征研究。由此产生的蛋白酶活性的最佳温度黑曲霉属，黄曲霉属，镰刀菌属，分别在25-45°C。表中呈现的数据清楚地表明，真菌菌株在25-45℃下显示出最大的蛋白酶活性，在25-45℃下显示最大的蛋白酶活性，还记录了由此产生的蛋白酶30℃的最佳温度A. Fumigatus..真菌菌株在超过30°C时产生蛋白酶，但产量低于在最佳温度下产生的蛋白酶。这种温度可能不适合酶的产生。这和丹尼尔的审查是一致的et al .,(2010)指出，温度的升高导致不活动的增加，但活动的增加是有限的，因为更高的温度导致活动的急剧减少。这可能是由于蛋白质结构的变性。

对纯化的真菌菌株进行物理化学表征，以检测pH(3-9)和温度(25-45ºC)的影响。pH对真菌生长的影响表明，在酸性pH i.e3条件下，真菌菌株的生长速度最快。一些菌株aspergillus.在碱性pH-9条件下生长最大。它们在4岁时生长最大^TH.潜伏期，之后略有减少。易于制备表面pH值在3-9左右的pH梯度琼脂平板。该梯度足够稳定，可以区分不同菌种在不同pH值下的不同生长特征。pH值对生长率、分生和色素形成的影响与其他工种的结果一致。惠勒et al .,(1990)报道了pH对61株真菌生长速率的影响。四种aspergillus.在pH值3-9和温度37ºC范围内增长。在一般情况下aspergillus.在3.0 - 9.0和(25-45ºC)的不同温度下，研究了温度对真菌菌株的影响。所有菌株的最适温度均为25ºC。结果清楚地表明中嗜菌菌株的存在aspergillus.和镰刀菌素sp。发现最大增长是在4中发生的^TH.天的孵化。随着温度升高至45℃，生长逐渐减弱。在不同温度范围间隔24小时后定期测量菌落直径。

表3:在选择pH条件下温度对真菌生长的影响

时间	Aspergillusglaucus			Aspergillusfumigatus			镰刀菌素sp。
	温度在ph-9			TEMP在pH-8			临时在ph-6时
	25 ešC	35 ešC	45ëCHC.	25 ešC	35 ešC	45ëCHC.	25 ešC	35 ešC	45ëCHC.
24小时	9.	4．5	1．5	6.5	6.5	2．5	5.	4.	4.
48小时	15.	7.5	3.	12.	11.	4.	13.	7.5	4．5
72小时	22.	15.	5．5	20.5	15.5	6.5	24.	13.	8.5
96小时	30.	17.5	12.	30.	22.	11.5	33.5	18.5	13.5
时间	镰刀菌素sp。			Aspergillusnidulans			镰刀菌素sp。
	TEMP在pH-8			临时在ph-6时			临时在ph-6时
	25 ešC	35 ešC	45ëCHC.	25 ešC	35 ešC	45ëCHC.	25 ešC	35 ešC	45ëCHC.
24小时	7.	3．5	3．5	8.	2．5	4.	3．5	3．5	4.
48小时	13.	11.5	4．4	15.5	6.5	5.	13.5	7.5	5.
72小时	25.	15.	10.	17.5	10.	7.5	18.	15.	6.5
96小时	40	16.5	12.5	24.	14.	14.5	26.	18.5	11.
时间	镰刀菌素sp。			aspergillusflavus.			aspergillusniger.
	TEMP在pH-8			临时在ph-6时			临时在ph-6时
	25 ešC	35 ešC	45ëCHC.	25 ešC	35 ešC	45ëCHC.	25 ešC	35 ešC	45ëCHC.
24小时	8.5	5.	5.	8.5	4．5	6.5	10.5	4．5	7.5
48小时	12.5	11.5	7.5	15.	6.5	8.5	12.5	6.5	9.5
72小时	24.	13.5	9.	27.	11.	11.5	25.	9.5	12.5
96小时	36.5	16.	14.	32.	15.5	15.5	34.	14.	16.5

纯化真菌菌株的酶学筛选

酶是人类通过微生物源获得的最重要的产品。酶是生物系统合成的高效环保蛋白质催化剂。在催化活性、在温和温度下工作的能力和大量生产的能力方面，它们比化学催化剂有显著的优势(Chand & Mishra, 2003)。JockichiTakamine博士(1914)是第一个认识到培养酶的机械可能性并将其展示给社会的人。尽管他主要关注真菌酶，Boidin和Effront(1917)是细菌生产酶的先驱。从那时起，微生物酶已经取代了植物和动物的酶(Underkofler, et al. 1957)。

表4:纯化真菌菌株的酶学筛选[菌落直径(mm)测定]

美国没有。	鉴定的真菌菌株	淀粉酶筛选淀粉水解试验	纤维素酶筛选刚果红染料试验	蛋白酶筛选
1	Aspergillusglaucus	+(1.5毫米)	+(2.0毫米)	-
2	Aspergillusfumigatus	_	+（1.0毫米）	+（8.5毫米）
3.	镰刀菌素sp。	+(1.5毫米)	+(2.0毫米)	+(9.5毫米)
4.	镰刀菌素sp。	+（1.0毫米）	+(2.0毫米)	+(9.0毫米)
5.	Aspergillusnidulans	_	_	+(10.5毫米)
6.	镰刀菌素sp。	+(1.5毫米)	+(2.0毫米)	+(8.0毫米)
7.	aspergillusflavus.	+(1.5毫米)	+(1.5毫米)	+（7.5毫米）
8.	aspergillusniger.	+（1.0毫米）	+(2.0毫米)	+(8.0毫米)
9.	镰刀菌素sp。	+（2.5毫米）	+(2.0毫米)	+(8.0毫米)

从不同土壤样品中分离得到9株真菌，并在最适pH和最适温度下进行酶解筛选。结果表明，在最适宜的环境条件下，这些微生物形态具有产生淀粉酶的能力．对纯化的菌株进行了淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶的产酶能力的筛选。其中大部分菌株是潜在的纤维素酶产生菌。酶合成的最大值出现在4^TH.之后逐渐减少的孵化日。pH和温度效应真菌菌株的酶活性。菌株aspergillus.和镰刀菌素sp。是酶的最大生产者。

Chellapandi(2009)报道aspergillusflavus.和aspergillerterreus.作为一种潜在的制革蛋白酶深层发酵生产菌株。为了提高蛋白酶的产率，对各种培养基成分进行了优化。对粗蛋白酶和部分纯化蛋白酶进行了初步表征，并用于实验室规模的制革厂脱毛工艺。从这些菌株中获得的蛋白酶在50ºC的宽碱性条件下表现出良好的活性，表明了在皮革和洗涤剂工业中应用的可能性。

结果也提高了各种工业过程中净化和应用的希望。这可以通过这些真菌菌株对蛋白质蛋白的蛋白水解崩溃具有重要意义，以建立酿造，烘焙，纺织品和洗衣等各个行业的强大和成本效益的过程。

目前的研究提出了进一步表征这些真菌菌株的酶特性和利用工业应用的希望。

表5：鉴定真菌样品：用他们的代码确定真菌培养物

不	样本网站	特点	真菌sp.
1	KO / SS / F1;民大/ SS / F1; TA / SS / F2;JH / SS / F3;BJO / SS / F2;SN / SS / F4	增长率速度缓慢，菌落的质地从柔软变化到粉状，分枝头被辐射到松散的柱状。Conidiophores是光滑的围墙。Conidia是椭圆形或圆形的。	aspergillus glaucus *
2	是的/ SS / F1;是的/你/ F1;	琼脂培养基中的殖民地广泛传播和严格的天鹅绒般。从	aspergillus.
	RA / SS / F2;跨国公司/ SS / F3	绿色到深绿色，随着年龄增长几乎变黑。分生孢子梗短，通常密被拥挤。分生孢子在团块中深绿色，球状。	用烟熏消毒* *
3.	RA / SS / F1;SU / SS / F2;AKH / SS / F2;	它生长为螺旋形，这是圆柱形的螺纹结构。菌丝在他们的尖端（apices）生长;新的菌丝通常通过沿现有菌丝的新提示通过称为分支的过程形成。菌丝是豆腐，其被分成由交叉壁分开的隔室。	镰刀菌素sp * * *
4.	TA / M / F1; SN / SS / F3; MNC / SS / F2	在琼脂培养基中的菌落广泛地分布在从肉桂色到更深的地方	Fusarium sp ****
	JH / SS / F2; MKH / SS / F3	年龄棕色阴影，蔓延天鹅绒般。与光滑的墙壁，豆腐的鸡尾酒。
5.	SU / SS / F1; MKA / SS / F2	在琼脂培养基上的菌落，广泛地呈深绿色。分生孢子头短，柱状具光滑的壁。分生孢子球形和绿色的质量。	aspergillusnidulans ^
6.	洛杉矶/ SS / F1;洛杉矶/会/ F1	在琼脂培养基上广泛分布的菌落在第一个点时是白色的，4-5天后变成绿色，可能会呈现不同深浅的淡绿色。营养菌丝,有隔膜的。分生孢子梗作为气生菌丝的分支出现。	Fusarium sp。^^
7.	又名/ SS / F2;MKH / SS / F2; MKA / SS / F1;维也纳总医院/ SS / F1; KO / SS / F2;RA / SS / F3	菌落在琼脂培养基中广泛扩散到稀疏生长。分生孢子的颜色从柠檬绿色到木犀草绿色不等。分生孢子梗分别产生，向上扩大和粒状。每个菌落的头状体大小不一，小到只有几条分生孢子链，大到大量。分生孢子几乎光滑。	Aspergillusflavus ^ ^ ^
8.	MKH / SS / F1;SN / SS / F2; KO / SS / F3 TA / SS / F1; SU / SS / F3; LA / LL / F2; JH / SS / F4 AKA / SS / F1; MUC / SS / F2 BJO / SS / F3	菌落在琼脂培养基中快速生长，菌丝丰富，分生孢子体光滑，有隔膜。分生孢子头呈黑棕色至碳黑色，从链状的小分生孢子团到球状或放射状的分生孢子头。	Aspergillusniger¤
9.	JH / SS / F1;BJO / SS / F1; SN / SS / F1	菌落在琼脂培养基中快速生长，颜色白色，膜质。菌丝有隔膜的。分生孢子梗短，直立和产生分生孢子链在其顶端。	Fusarium sp¤¤

讨论

微生物生态学的主要目标是了解自然栖息地的微生物多样性;因此，知识微生物和栖息地是必不可少的。选择总共14个位点用于样品收集，用于分离真菌菌株，定量地，真菌培养物的数量很大，分别显示在表1和2中。从十四个样品位点分离了共有四十份真菌培养物。经过临界形态观察（殖民地颜色，菌落形状，色素沉着，生长模式，在五天的生长模式）和微观观察中，发现许多真菌培养物类似，发现存在于多个位置并用不同的上标表示。鉴定的真菌菌株是，曲霉属植物，曲霉属植物，曲霉血花，曲霉毒素，镰刀菌。，叶片。结果表明，Ludhiana地区与微生物菌群蓬勃发展。以上结果还通过GOYAL提前确认了孤立研究等2008年,耆那教徒的等2005. pH对生长的影响aspergillusglaucaus.和Aspergillusfumigatus在pH-9（碱性pH）下显示出最大增长。测定菌落直径I.E1.5mm。48小时后的增长增加。在96小时后观察到孢子。aspergillusflavus.表明最佳pH被记录I.E酸性pH-6。在96小时后测量菌落直径为12.5。48小时后，显微镜孢子在微观上观察到绿色孢子。用真菌菌株观察到类似的结果。最佳pH为6，菌落直径为12.5。在96小时后观察到孢子素。表1和2中所示的数据表示Aspergillusfumigatus在碱性pH值为8的25ºC下生长最大。间隔24小时后测定菌落直径。25ºC 96小时后菌落直径最大为30 mm。中嗜真菌菌株，Aspergillusfumigatus在25ºC的酸性pH(即6)下生长。当温度升高至45ºC时，生长速率降低。结果表明，在pH为8的条件下，最适生长温度为25ºC镰刀菌素sp。96小时后菌落直径达到40 mm。中嗜真菌菌株的存在Aspergillusnidulans．真菌样品在其最适pH(即6)下生长，记录的最适温度为25ºC，菌落直径最高为24 mm。的压力aspergillusflavus.＆aspergillusniger.．在酸性pH值(即6)下，最适温度为25ºC。升温至45ºC后，观察到的生长非常少。

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