当前世界环境

介绍

这些包括空调冷却塔或蒸发冷凝器^1-4．它也被从地表水、小溪和河底的泥浆中分离出来⁵以及与流行病无关的湖水。在自然环境中，这种细菌生活在淡水变形虫体内，如棘阿米巴和Hartmenella，但这种生物也可以通过吸入受污染的气溶胶感染人类。肺泡巨噬细胞的侵袭和复制可导致免疫功能低下或某些潜在疾病降低肺防御机制效率的个体肺炎或“军团病”⁶．

这些数据表明军团菌分泌IV型效应器到宿主细胞液中，以靶向特定的宿主运输途径，从而重塑新生液泡^7，8．退伍军人仅在未经处理的地下水(GW)和温度低于20°C的处理水中偶尔发现^{9 - 11}．原代巨噬细胞来源于A/J小鼠的骨髓，与溶酶体途径的相互作用只是延迟的，因为RV最终成熟为一个酸化的液泡，这一过程类似自噬¹²．

除了退伍军人军团病的病原体，现在有其他四种可能的种类军团菌¹³：军团菌micdadei (pittsburgensis),军团菌Dumoffii，军团菌bozemanii,军团菌gormanii。除了L. gormanii之外，所有这些物种都被隔离为包括肺炎在内的疾病的病原体^14、15．

但是，如果这些或其他生物代表潜在的病原体，则尚不清楚，因为代表退伍军人血清组和基因型也表现出明显的传染性差异。采用添加抗生素的半选择性缓冲炭酵母提取物(BCYE)琼脂培养基检测可培养物军团菌^16、17．

菌株的l . micdadei都是从病人血液中分离出来的。l . micdadei也已从患者中分离出来并显示是肺炎的致病因子^18、19．这种微生物也已从环境源中分离出来，特别是从呼吸治疗设备的雾化器中分离出来^20.．退伍军人是超过90%的军团病报告病例的原因吗²¹．目前,大约50军团菌已经定义了物种，其中近一半与疾病病例有关(例如，退伍军人，L. micdadei, L. bozemanii, L. longbeach，和l . dumoffii）²²．

的能力军团菌这些作者还得出结论，水温对物种组成有影响²³．l . gormanii是从军团病爆发调查期间从河堤收集的土壤中分离出来的。这种微生物与军团病或其他人类疾病的关系目前尚不清楚，尽管有证据表明它可以引起人类和动物感染²⁴．这些分离物，被称为军团菌例如生物(LLO)。

目前用于分离的程序退伍军人和其他军团菌spp。有机体可以从几内亚分离出来猪组织或蛋黄囊上的炭酵母提取物(CYE)琼脂电镀培养基²⁵．除了由于冗长乏味，这种方法的成本很高实验动物、鸡蛋和时间。这个过程可能需要几个星期，不允许快速标本的处理，这可能是至关重要的在流行病调查中的重要性。

此报告描述用于隔离的选择性隔离过程军团菌直接从环境样本中提取，无需动物或鸡蛋接种。该程序利用选择性培养基组成的CYE琼脂与四种抗生素添加:头孢菌素，粘菌素，万古霉素和环己亚胺。退伍军人能在短时间内相对抵抗低pH值吗²⁶．我们的结果表明，回收率军团菌来自环境的水样如果用酸处理，然后在选择的琼脂培养基上电镀，将得到改善。

材料和方法

菌株

股票文化退伍军人用在人工培养基上经过多次的细菌进行平板计数和抗生素最低抑菌浓度测定。该菌株在本报告中被称为“砧木菌株”。将该砧木菌株进行48小时的CYE琼脂培养，悬浮在含有40%甘油的酵母提取液中，分成小份，在-70℃冷冻。将一个小瓶解冻，在CYE琼脂上划线，每周使用。

另一种文化的退伍军人，在这份报告中称为“组织菌株”，从未通过人工培养基传播。组织菌株以浸渍脾脏组织的形式保存于感染该病的豚鼠。感染脾脏浸渍后，分成小份，-70℃冷冻。在每次实验中，一个小瓶被解冻并在磷酸盐缓冲盐水中以1:5 000稀释，然后被放置在待测试的培养基上。

环境水样

在此使用的环境样本研究对象来自北方邦的不同地区这些标本来自于军团菌或LLO已经和豚鼠/鸡蛋分离出来了吗接种方法。有些样本是在疫情调查期间收集军团病暴发，但可能与暴发没有关联。样本使用前在4°C保存2 - 18个月在这项研究中。

媒体

本研究中使用的CYE琼脂包含1.0%酵母提取物(Hi-Media)， 1.7%琼脂(Biogene)， 0.15%活性炭，0.04%盐酸半胱氨酸，0.025%焦磷酸铁(可溶)。在高压灭菌和添加半胱氨酸和焦磷酸铁后将pH调整到6.9到7.0。选择培养基的制备是将抗生素的溶液加入到50°C水浴中高压灭菌的CYE琼脂中，直到立即倒入平板。

酵母提取物肉汤由1.0%酵母提取物(Hi-Media)溶液组成，其中0.04%盐酸半胱氨酸和0.025%焦磷酸铁经高压灭菌后加入。将肉汤的pH调整为6.9 - 7.0。FG琼脂(Mueller-Hinton，添加0.04% l -半胱氨酸盐酸盐和0.025%焦磷酸铁，pH为6.9至7.0)用于检测推定为褐色色素的分离株的产生军团菌．另一种培养基，酵母提取物-酪氨酸琼脂，由1.0%酵母提取物(Hi Media)， 1.7%琼脂(Biogene)和0.04% l -酪氨酸组成，也被用于检测棕色色素的产生，因为许多生物很难在FG琼脂上生长，在酵母提取物酪氨酸琼脂上生长令人满意。

直接电镀环境样品

两种10倍稀释的环境标本在pH 7.2至7.3的磷酸盐缓冲盐水中制备。每种0.1毫升稀释剂和未稀释的标本进行扩散在CYE和选择性琼脂板表面一式两份。将培养皿置于35°C2.5%的二氧化碳。车牌在5 6 7和有形态的菌落培养10天与…相似军团菌(白色,闪闪发光,凸的，圆形的，完整的，从1到2毫米直径下有“磨砂玻璃”的外观放大)。在每次阅读的时候殖民地被认为是军团菌是亚文化到新鲜的CYE琼脂。所有菌落的平板总数记录时间为10天。

酸性缓冲液处理环境样品

预处理用的HCl-KCl缓冲液通过混合3.9ml来制备水样品0.2 M盐酸与25 ml 0.2 M氯化钾生成缓冲液pH值约为2.2的溶液。两个工序代号为“A”和“B”治疗使用。在程序A中，将10 ml水样在无气溶胶离心容器中以4000 rpm离心10分钟。倒出上清，将沉淀物重悬于1ml的原始水样中。用盐酸-氯化钾缓冲液1:10稀释悬浮液。每隔5 - 60分钟，从酸悬浮液中取出0.1 ml，并在重复的CYE琼脂板和选择性培养基上进行电镀。每次间隔后，用磷酸盐缓冲盐水将样品按1:10稀释，然后以0.1 ml的量在重复的CYE和选择性培养基板上进行电镀。

步骤B不涉及离心，但涉及将0.5ml水样品加入4.5ml HCl-Kcl缓冲液。以5至60分钟的间隔，将0.1ml数量的未稀释和稀释（1:10在磷酸盐缓冲盐水中）酸处理的水样物覆盖到Cye和选择性培养基上。该过程导致电镀10和10-2稀释的水样品，当镀电时比根据程序A制备的样品更稀释10倍。

用酸处理悬浮液接种的平板进行培养，读取，并按上述直接电镀水样的方法进行计数。

筛选嫌疑人军团菌隔离

每个殖民地都被认为是军团菌是划线分离到CYE琼脂平板(含无抗生素)，培养2至5天。从每个这样的板，将分离物划线到酵母上提取酪氨酸琼脂(或FG)和5%的羊血琼脂。血琼脂在5潜伏期(军团菌典型的失败在血液琼脂上生长）或者如果孤立生产酵母提取物-酪氨酸琼脂或FG的褐变琼脂，用荧光抗体检测(FA)染色法结合抗血清的五种军团菌．多价FA阳性的分离株退伍军人共轭更进一步通过FA检测与类型特异性共轭l瞭解血清组1 - 6。如果英足总结果表示一个军团菌物种，孤立是检查细胞脂肪酸特征的军团菌物种，以确认如果脂肪酸谱显示如果该分离物在血琼脂上不生长或在FG或酵母提取物酪氨酸琼脂上不产生褐变，则为革兰氏阴性，其他方面类似军团菌，该隔离物被认为是LLO^{27日、28日}．

选择性媒体实验

确定纳入的适宜性选用粘菌素和头孢菌素分别添加到CYE琼脂中的水平。底片计数退伍军人股票在选择培养基和不加抗生素的CYE琼脂上分离菌株。此外,10环境样本被直接镀在上面媒体如上所述。随后,4μg/ml头孢菌素Cye琼脂，具有不同含量的Colistin（2,4,8，16、32μg/ml)浓度。的退伍军人股票菌条和两个环境标本被镀在上面以头孢菌素和粘菌素的浓度分别为5 μgof / ml和16μgof / ml为最佳选择培养基，并在此培养基中加入2种浓度的头孢菌素万古霉素(3和0.5μg/ml)。在这两个选择性培养基，也可在CYE培养基、板上的种群品系计数退伍军人是完成了。使用cephalothin-colistinvancomycin(闭路)琼脂和CYE琼脂，五环境水通过使用该方法电镀样品描述。

Edelstein-Finegold (E-F) medium (CYE agar with 40 U of polymyxin B and 0.5μg of vancomycin per ml) was compared with CCV medium (CYE agar with 4μg of cephalothin, 16μg of colistin, and 0.5μg of vancomycin per ml) for isolation of军团菌和抑制非军团菌生物。10个环境水样本军团菌已分离，用豚鼠/鸡蛋接种。样品在不含抗生素的E-F培养基、CCV培养基和CYE培养基上按上述方法进行稀释和电镀。这些盘子都经过仔细阅读和挑选军团菌测定菌落和总平板计数，以评估总菌群的抑制作用。

最后，为了提高CCV培养基的选择性，我们添加了环己亚胺(一种抗真菌剂)，因为需要延长的培养时间(10天)来恢复军团菌有时会导致真菌过度生长。菌种与组织菌株的平板计数比较退伍军人在含有各种浓度环己酰亚胺的CCV培养基上，得到80μg每毫升环己酰亚胺作为最佳水平。已经显示为具有叠叠的十三个环境水样军团菌将LLO分别以4μg的头孢菌素、16μg的粘菌素、0.5μg的万古霉素和80μg的环己胺(CCVC培养基)分别置于CYE琼脂上，且不加抗生素。

酸处理实验

评价低pH对废水处理的影响的生存军团菌经过一段时间，我们暴露了种群的紧张退伍军人到HCl-KCl缓冲液(pH为2.0)作用时间为5,15,30，和60分钟。酸悬浮液的板数每次试验结束后进行原株试验间隔。

五个水样已经显示出阳性退伍军人采用豚鼠/鸡蛋接种法，按照A程序进行HCl-KCl缓冲液处理30 min，并尝试恢复军团菌．使用0-，5-，15-和30-最小的曝光时间向HCl-KCL缓冲液进行重试，将两个天然污染的环境水样，LS-4和MI-56重新测试，以确定酸缓冲液处理的最合适的暴露间隔。在最后一个实验中，将酸缓冲液处理（方法A和B）为5分钟，并将样品直接覆盖到Cye培养基和CCVC选择性培养基上，以便在分离中进行功效军团菌从11个环境水样中检测出军团菌用豚鼠接种法。

结果

的成长退伍军人股票抑制含有8个细胞培养基的菌株或每毫升16μg骨滴管，但最小抑菌浓度为l瞭解据报道据报道为16μg/ ml21,22。虽然最小抑制浓度粘菌素的浓度为3.6μg/ml不抑制生长退伍军人(股票和在我们的研究中，即使在7.2μg/ml的水平。如果一种抗生素要成为一种有效的药物媒体必须抑制除此之外的细菌军团菌，然而，7.2μg/ml的粘菌素剂量不够减少10个环境总板数与总板数比较不含粘菌素的CYE。平均总板块未使用抗生素的病例为7.7 × 1057.2μg粘菌素每ml为2.5 × 105。

采用头孢菌素-粘菌素培养基(CYE琼脂，每ml 4μg头孢菌素和16μg粘菌素)分离退伍军人组1从1到2个环境样本，但平均抑制量的竞争非-Leginella植物群小于1个日志。CCV培养基（Cye琼脂，每mL，4μg骨滴注素，16μg的菌根和0.5μg的万古霉素）比Cephalothin-Colistin培养基更抑制磨削殖民地，并且表现出很少的抑制l瞭解库存压力。在CCV琼脂上培养的5个水样中有3个产生l瞭解，一个样本产生了两个血清组退伍军人．

表1:所有生物的总平板计数比较(Legionellae和非Legionellae) 点击这里查看表格

表1列出了孤立的军团菌和LLO，并给出所有微生物的总平板计数结果，用于比较CCV、E-F和CYE培养基的抑制特性。CCV培养基在抑制环境标本竞争菌群方面优于E-F和CYE培养基。此外,军团菌10个样品中有4个在CCV培养基上分离到LLO，而E-F和CYE培养基上没有分离到LLO。

当CCV加80μg环己酰亚胺每毫升(CCVC培养基)时，用13个环境水样进行电镀，这些水样已经被证明是阳性的军团菌CCVC培养液和LLO阳性7例，未加抗生素的CYE阳性3例。然而，cye上的三个分离株中有两个是从相对没有竞争菌群的氯化水样中回收的。

在实验中做了酸缓冲法的开发，得到了退伍军人股票显示应变是抗酸30分钟。股票的平皿计数应变减少从6.3 X 108菌落每毫升0分钟酸6.1 X 108 30分钟和60岁6.8 X 107分钟。当时有五个环境样品暴露在酸缓冲从30分钟(见材料和过程方法),l瞭解第1组从5个样本中的2个中回收。三种不屈服的样品之一退伍军人产生了LLO分离物。然而，后来检测的两个样本中发现了退伍军人在酸性缓冲液中暴露5分钟而不是30分钟。在此情况下，两种样品在接触HCl-KCl缓冲液5分钟后，总菌群减少了约2个对数，表明5分钟是酸缓冲液处理的有效暴露间隔。

表2三种方法的疗效比较军团菌从已知为阳性的水样中提取军团菌 点击这里查看表格

表3:动物接种/鸡蛋法和直接培养基分离法军团菌分离株的类型比较 点击这里查看表格

表2列出了酸缓冲液A和B与直接镀在CYE培养基和CCV选择性培养基上的比较结果。直接电镀可分离出退伍军人组5取自一份水样(MI-56)。其中5个水样在直接电镀后产生LLO。使用程序B时，11个样品中有2个产生军团菌， 3个只产出LLO。当使用程序A时，产生5个水样军团菌5个生产LLO。

采用豚鼠/鸡蛋接种法和酸前处理/电镀法对15份环境样品分离的菌株进行分析，发现菌株种类和血清群多军团菌(表3)。组或种之间最明显的差异是，6个样品直接在平板培养基中分离出LLO，而豚鼠/鸡蛋接种法只分离出1个LLO。

讨论

程序A优于两个直接在CYE和CCVC上进行电镀，并按程序B进行电镀隔离军团菌．酸缓冲液处理后，给出了用于电镀的CCVC选择性介质结果略好于CYE培养基。然而,一个退伍军人分离物在cyec培养基上回收，在CCVC培养基上未回收。这可能是巧合而不是结果抑制退伍军人通过选择性介质，但正因为如此，我们建议两者都要当样品被污染时，使用CYE和CCVC培养基酸缓冲液预处理^{29、30、31日}．

此时无隔离方法军团菌可完全替代豚鼠/鸡蛋接种方法。由于我们的环境样本包含大量和多样的菌群，没有一个单一的抗生素组合测试有效地抑制所有样本中的竞争菌群。即使是酸缓冲液与CCVC选择性培养基和CYE培养基结合使用，也能达到回收的目的军团菌只有45%的水样含有军团菌．但是，在时代之间的某些情况下，它已经一年多了军团菌已从豚鼠或鸡蛋中分离出来，我们做了这项研究的时间。军团菌在一些水样中可能仍然不可行，酸预处理/介质方法可能比我们的结果显示的更有效^{32 33 34 35}．

在选择培养基CCVC琼脂上不经酸缓冲液处理直接电镀，回收率可达36%军团菌来自我们研究中使用的环境样本。对于LLO的分离，它似乎确实比动物接种更敏感，这可能表明这组微生物对豚鼠的致病性较低(表3)。这些微生物被认为可能是新的军团菌因为它们有许多相似的特征军团菌．

CCVC培养基在临床分离中的应用退伍军人和其他军团菌物种有待评估。E-F培养基的环境分离效果不如CCV培养基军团菌，已被证明是有效的隔离退伍军人从临床标本中分离，尽管其对其他物种的分离效果军团菌是未知的。

确认

作者感谢印度Jhansi, 284128 (U.P.) Bundelkhand大学生物技术系J.C. Bose生命科学研究所为这项研究提供了资金支持和实验室设施。

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