当前世界环境

介绍

根瘤菌leguminosarum生物变型viciae是固氮菌一种杆状、可动的革兰氏阴性固氮细菌，能将氮固定在豆科植物上，如扁豆、豌豆和野豌豆^1，2这些像其他豆类一样重要在提供车身建筑矿物质，钙，维生素A和B，硫胺素，烟酸和油。^{3 - 7}

各种各样的研究包括奥镁(根际表达)基因正在进行豆类-根瘤菌互作，以提高产量。这些基因形成一个操纵子，由奥镁美国广播公司(ABC)。操纵子位于邻近的奥镁共生质粒R。leguminosarum生物变型viciae。⁸根际表达基因受奥镁R.奥镁R在根瘤形成中起重要作用。根据高等．，⁹植物细菌的群体感应系统，Mesorhizobium huakuii影响生长速率和共生结瘤。的奥镁R编码rir，这是一种作为转录激活因子的调节蛋白。rir与LuxR同源，属于LuxR- luxi家族。这类转录激活因子对各种革兰氏阴性菌是常见的^10、11包括在鱼类病原体中鉴定的群体感应信号分子和LuxRI同源物迟缓。¹²n -酰基高丝氨酸内酯的综合图谱鼠疫伪使用液相色谱偶联至杂交四杆 - 线性离子阱质谱仪显示微生物属于该组转录激活剂生产商。¹³铜绿假单胞菌拥有LasR这功能激活毒性。农杆菌属农合成轨迹，其负责共轭控制。^{14日至17日}还，农杆菌属葡萄青鸾luxR同源物，艾里尔这与葡萄的坏死和烟草的过敏反应有关。¹⁸LuxR家族蛋白SpnR是n -酰基高丝氨酸内酯依赖性群体感应的负调控蛋白粘质沙雷氏菌¹⁹．LuxR在费氏弧菌调控操纵子的表达勒克斯Icdabeg在vai存在（颤音自动挤出机，N-3-（氧己烷基）均静脉内酯，因此影响微生物中的发光。Luxr-Luxi家族是一种人口密度依赖性基因激活因子。

LuxR-LuxI家族表现出的调节机制被称为群体感应。它涉及到自我产生的细胞外信号化合物(自诱导剂)与转录激活蛋白的相互作用。在群体感应中，在获得足够的细胞密度后，自动诱导剂通常会积累，使细菌能够做出决定来调节特定基因组的表达^10年,20年．基于罗尔和Luxr家族之间存在的同源性，决定应对Quorum感应原则进行调查R。leguminosarumbv。viciae。为此，我们研究了细胞密度和突变对表达的影响奥镁细菌中的基因。这可能表明对参与共生特性的监管电路R。leguminosarumbv。viciae。

材料和方法

生物和生长介质

根瘤菌leguminosarum生物变型viciae是从美国型文化收集（Rockville，MD）中获得的。根瘤菌meliloti是由艾伦·唐尼提供的，他在英国诺里奇的约翰·英尼斯研究所进行了这项工作。r . leguminosarum生物变型viciae和r . meliloti缺乏共生(Sym)质粒这些已经治愈了它们的对准质粒的菌株。它们在最小的媒体中生长^21.和总酵母(TY)培养基(当需要时)

表1豆科植物芽孢杆菌菌株特异性。为蓖麻生产rhi基因诱导剂。 点击这里查看表格

试验生产的应变特异性奥镁基因诱导物。

指数生长期晚期培养物r . leguminosarum生物变型viciae和r . meliloti没有监管基因（奥镁R)的合成试验奥镁基因诱导剂碱性磷酸酶测定^22.使用一个奥镁C：：越南河粉融合基因。

测试细胞密度对奥镁基因的表达。

strainR.leguminosarumBiovar Viciae携带奥镁答::虫胶共混质粒和不共混质粒的Z融合基因在28℃培养⁰c在液体胸部，^22.以每分钟180转的转速摇晃^－1为72小时。活平板计数法测定细胞生长和β-半乳糖苷酶活性^22.是在潜伏期每隔6小时确定的

突变实验。

对中对数期细胞进行转座子(Tn5)诱变r . leguminosarum生物变型viciae。在平板上筛选了1150个突变体，用于生产奥镁由碱性磷酸酶测定的基因诱导剂如^22.米勒。在诱导剂合成中发现19个缺陷突变体，用液体法检测其碱性磷酸酶活性。^22.与突变体一起准备两个对照(阳性和阴性)。利用碱性磷酸酶米勒单位以上的0-500、501-1000、1001-1500和1501-对突变体进行分类。

图1所示。细胞密度和共生质粒对rhi基因表达的影响。 点击此处查看数字

β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶活性测定。

所描述的方法^22.米勒被雇用了。将B-半乳糖苷酶的略微修饰并如下进行。反应混合物含有0.9ml培养物和0.2ml异丙基-THIO-B-D-半乳糖糖苷。在室温下五分钟后再停止反应（27^oC) 0.5 ml 1 M Na₂有限公司_3.．在600nm和420nm处读取混合物的光密度。后一密度被修正以获得实际的光密度。b-半乳糖苷酶活性单位(米勒单位)定义为在本测定条件下，反应产物在420nm和600nm每分钟每毫升的吸光度。

结果

磷酸酶活性为Synyhesis奥镁R诱导物的r . meliloti是低相对于R。leguminosarum有或没有共生质粒表1.生长阶段受影响奥镁图。1.随着孵育时间的延长，菌落形成单位增加r . leguminosarum共生质粒存在或不存在的。两菌株的生长模式相似，但无显著差异。然而，在共生质粒存在时，b-半乳糖苷酶的活性随着细胞数量的增加而增加，最高为237.5米勒单位，而缺乏共生质粒的菌株为12.5-17.5米勒单位，图1。这一活性在指数期最高，在中对数期增幅明显高于其他任何生长期。

表2显示突变体在生产中存在缺陷奥镁不同水平的基因诱导剂。I类突变体(低产量)，诱导剂合成能力为145-250 Miller单位的磷酸酶活性，分别由9、15和16个突变体组成。II类突变体(中度生产者)的突变体数量为1、3、4、5、6、8、11和14，米勒单位为625 ~ 896。III类突变体(高产1031-1375个米勒单位)由突变体数量2、7、10、12、13、17和18个组成，而IV类(超级高产)突变体数量为单个成员19个，在1563个米勒单位具有诱导剂形成能力。相对于阴性对照和阳性对照

表2：突变对Rhi基因诱导症的影响。 点击这里查看表格

讨论

合成量大奥镁基因诱导者r . leguminosarum比r . meliloti表明该代谢物的产生对前者细菌是特异性的，因此表明只有某些根瘤菌种形成该化合物。的无能r . meliloti表达奥镁高水平的基因可能是由于位于共生质粒上的其他基因的存在，这些基因可以阻止适当代谢物的产生来诱导奥镁基因表达。

β-半乳糖苷酶活性在指数期最高，在对数中期增加明显奥镁当细胞处于生长的活跃阶段时，基因的功能达到最佳状态。因此，监管奥镁rhir基因是生长阶段和细胞密度依赖性。静止相位细胞似乎与对数相位细胞较少。虽然，生产和对N-酰基均静脉内酯的产生和反应的多样性^23.；这里得到的结果与福库报告的结果相似et al。，¹⁰和高等．，¹¹福库商学院et al。，¹⁰认为LuxR-LuxI家族的转录调控因子是依赖于细胞密度的弧菌，欧文氏菌，假单胞菌和农杆菌属．高等．，¹¹显示出生长和共生染色术与批量传感系统直接相关Mesorhizobium huakuii．许多相伴的植物细菌通过群体感应以细胞密度依赖的方式调控基因表达N-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)。这些ahl分子通过并进入细菌细胞。随着细菌的群体增​​加，AHL的浓度也增加。^24.

关于突变的数据意味着I类突变体在强烈缺陷奥镁基因诱导中，II类为平均缺陷型，IV类为突变型奥镁基因通过突变而增强，从而比野生型更好地表达基因。III类似乎不受野生型菌株的影响(阳性对照1和2)。这可能是因为奥镁本课程中的基因不受TN5突变的影响，与最后两类I和II相反，缺乏或产生较低或更高水平的代谢物。

结论

综合奥镁基因诱导剂是特异性的r . leguminosarum生物变型viciae。表达的细菌奥镁细胞密度依赖模式中的基因。共生性质粒对其作用是至关重要的奥镁基因;奥镁基因诱导受到影响奥镁r位于共生质粒上。TN-5突变影响了奥镁基因诱导。

致谢

作者感谢英国文化协会、英国约翰英尼斯研究所和尼日利亚阿库雷联邦理工大学在这项研究工作中提供的资金支持和所需的仪器。

参考

1. 《豆科植物根瘤菌的结瘤作用》。见:我国固氮及其研究。在香港,d . (ed)。第十六章:316-333(1992)。
2. 布鲁温，新泽西，安布罗斯，M. J.和唐尼，J. A.，根瘤，根瘤菌和固氮。:分子生物学和生物技术。凯西，R.和。戴维斯，D. R.(eds)。植物遗传学报，37- 39(1993)。
3. 张文杰，提高生物固氮能力。1974年6月6日的研讨会论文集。由能源相关综合研究和能源部赞助生物和医学科学美国。国家科学基金会华盛顿州，D。c(1975)。
4. 低地湿润热带地区谷物豆类的营养作用。热带农业系统的生物固氮，Ayanaba, A.， Dart，P。J.（ed）。（1977）45-61。
5. 豆类接种试验。共生固氮技术手册罗马:联合国粮农组织，VI EXPE(1983) 1:1 /7-7/7。
6. Singh，S. R.，Iita粮食豆类改善计划的影响。尼日利亚国际热带农业研究所年度报告，尼日利亚。（1984）5-33。
7. 埃塞尼，D。，埃塞俄比亚生物氮固定的研究状态。在：非洲的生物氮固定。非洲生物氮固定结社的最后一次会议的诉讼程序。Ssali，H.和Keya，S. O.（EDS）。（1985）45-61。
8. 库博，M. T.， Economou, A.， Murphy, G.， Johnston, A. W. B.和Downie, J. A.， J. A.，根际表达基因的分子特征和调控奥镁ABCR可影响结节形成根瘤菌leguminosarum．J Bacteriol。,174年(1992年):4026 - 4035。
9. 高，Y.，Zhong，Z.，Sun，K.，Wang，H.和朱，J.，植物细菌中的批量传感系统Mesorhizobium huakuii影响生长速率和共生结瘤。植物和土壤，286年(2006年):1 - 2。
10. 细菌的群体感应:细胞密度响应转录调节因子LuxR-LuxI家族。J细菌.，(1994) 176: 269-275。
11. N-酰基高丝氨酸内酯与革兰氏阴性细菌的通讯:一种通用语言?Microbiol趋势.，(1994) 2: 193-198。
12. 田志刚，田文华，田志刚，等。鱼类病原菌群体感应信号分子和LuxRI同源基因的鉴定爱德华菌属获得性迟发性．j . Biosci。Bioeng．，(2004) 98(4): 274。陈志强，陈志强，陈志强，等。n -酰基高丝氨酸内酯的合成与结构分析鼠疫的伪使用液体色谱-混合四极线性离子阱质谱联用。分析和生物分析化学，(2007) 387(2): 497。
13. 李志强，李志强，李志强，等。细菌荧光特性的研究进展颤音fischeri．细胞，（1983）32：773-781。
14. Gambello, M. J.和Iglewski, B. H.，克隆和特征假单胞菌绿脓杆菌拉斯维加斯R基因，转录弹性蛋白酶的激活剂。j . Bacteriol, 173, 3000 - 3009。
15. Piper，K.R.，Bodman，B. V.和Farrand，S.K.，缀合因子农杆菌属农调节Ti质粒转移autoinduction。自然(伦敦)，(1993)362:448-450。
16. LuxR-LuxI型调节系统在植物肿瘤代谢物存在时激活Ti质粒的偶联转移。J细菌。，（1994）176：2796-2806。
17. 郑东，张海涛，张海涛，郝广，霍顿，M. R.和伯尔，T. J. A .luxR同源物，艾里尔,在农杆菌属葡萄与诱导葡萄葡萄和过敏反应诱导烟草的诱导有关。摩尔。Plant-Microbe交互(2003) 16(7): 650。
18. Horng，Y-T。，Deng，S-C。，Daykin，M.，Soo，P-C。，Wei，J-R。，LUH，K-T。，HO，S-W.，SWIFT，S.，LAI，H-C。威廉姆斯，P.，Luxr家族蛋白质SPNR用作Selratia Marcescens的N- acylhomoserine内酯内酯依赖于N- acylhomoserine内酯内酯的负调节剂。摩尔。Microbiol。，（2002）45（6）：1655-1671。
19. Lithgow, J. K.， Wilkinson, A.， Hardman, A.， Rodelas, B.， Wisniewski-Dye, F.， Williams, P.， Downie, J. A.， The regulatory locus cinRI in根瘤菌leguminosarum控制群体感应位点网络。摩尔。Microbiol．，(2000) 37(1): 81 - 97。
20. Jordan，D. C.，I.在：Bergey系统细菌学手册。Krieg N. R.和Holt，J.G。（EDS），威廉和威尔克林有限公司巴尔的摩。(1984) 237。
21. 《分子遗传学实验》。冷泉港实验室，普莱恩维尤出版社，纽约，(1976)352-355。
22. Jafra，S.，Jalink，H.，Van der Schoor，R.和Van der Wolf，Pectobacteriumcarotovorum亚普。Carotovorum菌株n -酰基高丝氨酸内酯的产生和反应表现出多样性。J. phytopathol.．，154年(2006年):729 - 739。
23. Winson, M. K.， Camara, M.， Latifi, A.， Foglino, M.， Chhabra, S. R.， Daykin, M.， Chapon, V.， Bycroft, B. W.， Salmond, G. P. C.， Lazdunski, A.， Stewart, G.S.A.B. and Williams, P.，多重群体感应模量交互调节毒性和次级代谢铜绿假单胞菌：鉴定信号分子N-butanoyl-L-homoserine内酯和N-hexanoyl-L-homoserine内酯。Proc。国家的。学会科学。美国．，92年(1995年):9427 - 9431。