马来西亚砂拉越休闲湖泊中微囊藻（Mcye）基因的检测
Rohaslinda穆罕默德1，Mohd。rafatullah.1＊Tengku Nadiah Yusof说1沈易经1和Norli伊斯梅尔1
1马来西亚圣公会大学工业技术学院环境技术部，马来西亚皮浪，11800马来西亚。
mohd_rafatullah@yahoo.co.in.in.
http://dx.doi.org/10.12944/cwe.11.3.02
由于许多国家在大多数水体中都存在有毒蓝藻，因此蓝藻爆发已成为一个世界性的问题。作为马来西亚蓝藻毒素监测的一部分，我们在沙捞越的米里五个不同湖泊的12个地点采集了样本。采用聚合酶链反应(PCR)扩增蓝藻16S rRNA，检测水样中是否存在蓝藻。所有标本均检测到蓝藻16S rRNA。而蓝藻毒素编码基因的检测则采用特异性引物进行分子分析。结合前向引物对蓝藻毒素编码基因进行PCR扩增;mcyE-F2及反向引物;mcyE-R4扩增微囊藻毒素(mcye.）样品中的基因。收集的12个样品中，微囊藻（mcye.)在其中一个样本中检测到产生基因。微囊藻毒素编码基因的存在表明在沙捞越的米里存在蓝藻毒素的风险。
有毒的蓝藻;蓝毒性毒素;蓝细菌16s rRNA;PCR扩增;微囊藻
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王志强，王志强，王志强，等。微囊藻毒素(Mcye)基因在马来西亚沙捞越米里湖的检测。Curr World Environ 2016;11(3)。DOI:http://dx.doi.org/10.12944/cwe.11.3.02
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王志强，王志强，王志强，等。微囊藻毒素(Mcye)基因在马来西亚沙捞越米里湖的检测。Curr World Environ 2016;11(3)。可以从://www.a-i-l-s-a.com/?p=16545.
介绍
蓝藻，或者也称为蓝绿藻是具有独特特征的原核生物。与大多数原核生物不同，Cyanobacteria由叶绿素组成，使它们能够主要通过光合作用来获得营养素。细菌的光合作用对于其他生物体使用提供大气氧气是重要的。蓝藻也很重要，作为可再生能源和天然产品的潜在资源。1然而，Cyanobacteria过度生长导致在水环境中形成蓝藻菊花。绽放导致几个问题，如令人不快的气味和味道，最重要的是毒素的生产。2
By Cyanobacteria生产毒素的能力最早被弗朗西斯记录。3.然而，直到几十年后，人们才了解毒素的结构、基因组密码和生化途径。蓝藻毒素编码在一个独特的基因簇中，不是物种特异性的，而是基因特异性的。也就是说，同一种蓝藻细菌可能编码也可能不编码相同的毒素基因，而同一种毒素可能由几个不同的物种编码。毒素根据其毒理学效应可分为四大类:肝毒性毒素(微囊素和球毒素)、神经毒性毒素(尖胞毒素-a、尖胞毒素-a(s)和蛤蚌毒素)、细胞毒性毒素(柱状精子素)和皮肤毒性毒素(海兔毒素、莺毒素-a)。2，4，5
以前的记录显示，所有的毒素都对人和动物有害。1996年，巴西116例患者在常规血液透析治疗过程中直接接触蓝藻毒素，出现肝毒性和神经毒性症状，其中52例因蓝藻中毒死亡。这种症状现在被称为卡鲁鲁综合症。6曾多次努力分析蓝藻毒素对健康造成的危险，1999年，世界卫生组织(卫生组织)将蓝藻毒素列入饮用水准则和娱乐用水准则。
目前，泰国、越南、菲律宾、新加坡等全球超过65个国家在水环境中检测到有毒蓝藻，马来西亚在2015年证实了有毒蓝藻的存在7和产毒微囊杆菌沈毅静从槟榔屿Ayer Itam水库成功分离得到。8
因此，检测毒素编码基因的基因细胞至关重要，以澄清马来西亚毒素的状态。研究人员建立了许多有毒的蓝细菌检测方法。最常用于检测毒素编码基因蓝细菌的涉及分子键入方法，例如常规聚合酶链式反应（PCR）。研究了使用PCR，在Miri，沙捞越中，在Miri，沙捞越中对毒素毒素编码基因的存在。为了我们的最佳知识，这是检测编码微囊蛋白的毒素在婆罗洲马来西亚进行的第一次研究。
方法
抽样
该地区涉及沙捞越的一个地区，称为Miri。2015年6月在Miri周围十二点收集了样本。湖泊位于塔曼Tunku，Taman Awam Miri，Miri City Fan，Taman Bulatan和Taman Hilltop（图1）。一般来说，这些湖泊是砂拉越米里的住宅和娱乐区的人造湖泊。根据水体中的绿色生物的可见性选择这些取样位点，表明了蓝细菌的存在。在选择样品收集站时还考虑了可访问性和风向。
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DNA提取
根据细菌DNA提取试剂盒(Vivantis)协议从环境中进行DNA提取。简单地说，取1ml蓝藻样品，6000 rpm离心2分钟，滗出上清液。然后在颗粒中加入100µl Buffer R1，细胞完全重悬。在细胞悬液中加入10µl的溶菌酶。细胞悬液充分混合后在37℃孵育0C 20分钟。将消化后的细胞以10000 rpm离心3min成球，滗出上清。将颗粒重悬于180µl缓冲液R2中，加入蛋白酶K。细胞悬液充分混合，在摇匀机中孵育20分钟。加入两倍缓冲BG(约400µl)，多次混合，直到得到均匀的溶液。混合物在65℃下孵育10分钟0加入200μl绝对乙醇之前的C.然后将混合物转移到柱微泡中。将柱子以10,000rpm离心1分钟。通过洗涤缓冲液丢弃并洗涤流过流动。9柱以每分钟10,000转的速度离心1分钟。进一步以10,000 rpm离心1分钟，以去除残留的乙醇。最后，用预先加热的洗脱缓冲液将提取的DNA洗脱。
通过通过琼脂糖凝胶运转来观察DNA提取的效率。将提取的DNA储存在-20度直至需要。
PCR.
使用引物对CyA106F检测蓝藻16SRRNA，以及CyA781R（A），CyA781R（B）和引物的序列在表1中示出。10，11，12
表1：用于扩增蓝藻16s rRNA的引物的序列。
底漆 |
序列(5 '到3 ') |
CYA106F |
CGG acg GGT gag taa CGC GTG a |
cya781r（a） |
GAC TAC TGG GGT ATC TAA TCC CTT T |
cya781r（b） |
Gac tac agg GGT atc TCC CTT t taa |
* Cya781R引物用作CyA781R（A）和CyA718R（B）的等摩尔混合物。
*两种引物均采用反向引物;CYA781R(a)和CYA718R(b)针对形态不同的菌株，前者针对丝状蓝藻，后者针对单细胞蓝藻。13，14
使用MasterCycler®EP（EPPendorf）进行PCR扩增。PCR反应在含有12.5μl的2×Taq主混合物（Vivantis Technologies）的25μl反应混合物中进行，每种引物0.25μl（集成DNA技术）和2μlDNA样品与无菌蒸馏H合并2以25µL的体积为总反应量。PCR扩增蓝藻16S rRNA需要在95°C初始变性2分钟;然后是30个循环，每个循环在94°C下60 s，在60°C下60 s，在72°C下60 s;最后在72°C下延长7分钟。10，15
扩增后，将产物加载到1%琼脂糖凝胶上，该琼脂糖凝胶是通过向25 mL 1 × TAE缓冲液中加入0.25 g琼脂糖(Vivantis Technologies)制备的。2.5µL的凝胶染色(TransGen Biotech)加入到热琼脂中。PCR产物中加入2µL的6X载染剂(Vivantis Technologies)。凝胶在70v下运行40分钟，并使用Gel Doc进行观察TMXR + (Bio-Rad)。
通用微囊杆菌（mcye.）使用前底漆扩增的基因;Mcye-F2与反向底漆结合;mcye-R4。16，17而检测微囊藻毒素(mcye.基因特异性的微囊杆菌sp.使用引物对mcyE-F2和mcyE-R8，18微囊藻（mcye.基因特异性的Anabena.引物对mcyE-F2和mcyE-12R18和基因具体Planktothrix.sp.使用引物对mcyE-F2和mcyE-plaR316．微囊藻毒素基因扩增引物序列如表2所示。18
表2：用于放大的引物的序列mcye.基因
底漆 |
序列(5 '到3 ') |
mcyE-F2 |
Gaa Att TGT GTA Gaa GGT GC |
mcye-R4 |
AAT TCT AAA GCC CAA AGA CG |
mcye-R8 |
Caa TGG gag猫aac gag |
mcye-12r. |
Caa TCT CGG tat agc GGC |
mcyE-plaR3 |
CTC aat CTC agg agg acg at |
*引物mcyE-F2为微囊藻毒素基因的正向扩增引物。
为了mcye.基因通用引物，如下进行PCR方案：第一步是在95℃下2分钟的初始变性步骤，然后在94℃下在56℃和60s处的35次循环为72°C和72°C的最终延伸10分钟。15，16
PCR方案对于所有三种Mcye基因的特异性引物，涉及在95℃下初始变性的初始变性3分钟。用于微囊藻（mcye.基因特异性的微囊杆菌SP。，初始变性步骤之后是在94℃下在60℃下的30秒的25个循环，在60℃，60s处在72℃下。18而微囊藻毒素(mcye.基因特异性的Anabena.SP。，初始变性步骤后，在94℃，30℃下在58℃下，在72℃下为30℃，30s循环30次。18．用于微囊藻（mcye.基因特异性的Planktothrix.sp.， PCR方案涉及30个循环，在94°C 30s，在57°C 30s，在72°C 60 s16．所有PCR循环之后在72°C下延长10分钟。16，18
DNA纯化
PCR扩增后的DNA根据Ambiclean Kits (PCR & Gel)协议(Vivantis Technologies)进行测序，并送往化学生物学中心进行测序。利用Blast技术将序列与国家生物技术信息中心(NCBI)的现有数据进行比较。
结果
检测蓝藻16s rRNA
使用引物Cya106F与Cya781R（A）和CyA781R（B）组合的底糖杆菌16SRDNA扩增，以产生654-699bp的DNA片段，如图2所示。
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所有样品在凝胶电泳图像上显示明显的条带，表明蓝藻16S rRNA的存在(表3)，表明样品中存在蓝藻。
表3:2015年6月在沙捞越米里不同地点采集的蓝藻16S rRNA的PCR总结结果。“+”表示积极的结果，而“-”表示消极的结果。
样品 |
结果 |
Taman Tunku. |
+ |
所有样品均检测出16S rRNA蓝藻基因阳性，表明样品中存在蓝藻。
属类微囊藻毒素的检测(mcye.）基因
通用微囊杆菌（mcye.)基因扩增引物mcyE-F2与mcyE-R4结合，得到809 ~ 812 bp的DNA片段，如图3所示。
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只有Miri City风扇1，（泳道7）对于存在微囊藻基因（表4），而其他样品在凝胶电泳图像中显示出没有条带。
表4:泛型微囊藻毒素存在的PCR汇总结果(mcye.）在2015年6月，沙捞越在Miri的不同地点采取的样品的基因。'+'表示“ - ”表示负面结果的阳性结果。
样品 |
结果 |
Taman Tunku. |
- |
微囊藻（mcye.)，其余样品均为阴性，表明微囊藻毒素基因缺失。
微囊藻毒素的检测(mcye.基因特异性的微囊杆菌sp。，淡水藻类的一种sp。和Planktothrix.sp。
微囊藻（mcye.基因特异性的微囊杆菌sp。，淡水藻类的一种sp。和Planktothrix.mye - f2正向引物与mye - r8 (微囊杆菌sp), mcyE-12R (淡水藻类的一种sp.)和mcyE-plaR3 (Planktothrix.sp.)生成247bp的DNA片段，分别如图4、图5和图6所示。19，20.
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特异性微囊藻毒素基因PCR扩增微囊藻sp。，淡水藻类的一种sp。和Planktothrix.sp.在凝胶电泳图像中没有显示条带(表5)，说明微囊藻毒素基因没有被微囊藻毒素基因特异性引物扩增。21
表5:PCR概述结果对特定微囊藻（mcye.)基因检测Miri (City Fan) - plankton样本，结果显示属微囊藻毒素阳性。“+”表示积极的结果，而“-”表示消极的结果。
样本 |
毒素(mcye.基因特异性的微囊杆菌sp。 |
毒素(mcye.基因特异性的淡水藻类的一种sp。 |
毒素(mcye.基因特异性的Planktothrix.sp。 |
1、天津爆炸 |
- |
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- |
进行进一步的PCR扩增以确定产生微囊藻基因的属。但是，检测微囊藻（mcye.基因特异性的微囊杆菌sp。，淡水藻类的一种sp。和Planktothrix.Sp.显示阴性结果。
在检测微囊藻毒素呈阴性结果后(mcye.）针对属的基因，清洗PCR产物并送去测序以确定生成的微囊藻基因。将该序列与来自国家生物技术信息中心（NCBI）中的可用数据进行比较。从将序列与NCBI中的可用数据进行比较，所显示的序列的最高相似之处是微胞藻属绿脓杆菌（mcye.）基因（5' - 导致与基因库中可用序列相同的66％。
讨论
蓝藻16S rRNA和微囊藻素基因在整个研究中都存在。在沙捞越Miri和mirawak地区采集的所有样品中均检测到蓝藻16S rRNA基因，但微囊藻毒素(mcye.）基因仅在12个不同的场样品中仅检测到。2012年，Harith和Hassan22据报道，兰山池，塞拉瓦克的蓝细菌存在。从包括六属潜在的毒素生产属的池中记录了17种蓝藻物种;Cylindrospermopsis，念珠藻属，螺旋藻，颤藻属，Scytonema.和synechocccus.．然而，目前还没有从池中发现蓝藻毒素的报告。尽管蓝藻毒素有害，但马来西亚对蓝藻毒素的研究仍然有限。本研究是沙捞越游憩水蓝藻毒素检测的第一步和重要的初步步骤。
在热带国家的抽样可以随时在一年内随时进行，因为蓝色细菌绽放可能全年都发生。23然而，考虑到温度和风的天气，对于花青细胞的浓度，依赖于风的时间变化是很重要的。采样中蓝藻的差异浓度可以提供有关偶然游泳者的潜在毒性和毒素潜在进入饮用水的毒性的毒性数据的不准确数据。2虽然大部分时间不可见蓝藻绽放，但应对毒素生产是特异性的毒素生产，提醒和监测蓝藻毒素的存在。
分析方法被广泛应用于氰酸毒素的检测和定量，但该毒素的半衰期较短，且在环境中容易降解。因此，在本研究中，分子技术用于检测蓝藻毒素产生基因，因为产生毒素的能力是基因特异性的，而不是物种特异性的。在环境中，微囊藻毒素在化学水解和极端高温(>300â - μ C)条件下非常稳定。2因此可在细胞外积累数天至数年的环境24毒花期发生后。然而，利用高效液相色谱(HPLC)等方法进行毒素的直接检测是非常困难的。此外，微囊藻毒素容易被臭氧等强氧化分子降解，也容易被水生细菌分解2如Sphingomonas和铜绿假单胞菌24使使用分析检测的毒素检测更不可靠。
在检测产毒基因微囊杆菌，淡水藻类的一种,Planktothix.SP。，研究人员目标mcye.基因的MCYS.不同底漆靶标的基因簇。25存在的mcye.基因会立即确认环境中存在有毒的蓝藻细菌26作为mcye.基因编码蛋白质对于形成3-氨基-9-甲氧基-2,6,8-三甲基-10-苯基-4,6-癸二烯酸，（ADDA）和谷氨酸-1-半醛氨基转移酶。两种分子对毒性很重要。27研究表明，毒性迷失了Planktothrix.Sp.发生时，高达90%mcy基因群丢失了。28然而，基因簇中基因间区域的缺失可能对毒素蛋白的表达没有影响。29随后，mcy大多数文献采用基因检测作为分子标记来检测微囊藻素生成蓝藻。
总之，对于对微囊藻进行编码基因测试的十二个样品，检测到一个样品以具有基因。结果表明，Miri湖中的一个患有蓝藻毒素的潜在风险。该研究表明，这是第一次在婆罗洲婆罗洲检测到编码基因的第一次微阴囊素。所提出的数据对于砂拉达克娱乐水中的水风险管理和评估潜在毒素污染。
承认
作者非常感谢马来西亚圣恩大学通过USM RU拨款和MOE ERGS拨款提供的财政援助(拨款号:1001.PTEKIND)。811253和203.PTEKIND.6730135)。
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