当前世界环境

介绍

大多数细菌已经进化出一系列不同的高亲和力铁获取系统，这些系统依赖于低分子量铁螯合物的合成和/或摄取。¹铁载体及其取代衍生物在农业、环境和医学等领域有着广泛的应用。在农业中，铁载体产生菌的应用可提高土壤肥力和真菌病原菌的生防。最重要的应用是选择性给药，这是一种击败耐药细菌的特洛伊木马策略。特洛伊木马策略是最有希望的方法，专门攻击多种抗生素耐药菌株的细菌与生命威胁感染。其他主要临床应用包括治疗血色素沉着病、地中海贫血和透析性脑病等疾病。²Siderophore还用于减少来自土壤和水的环境中的金属污染水平。

据报道，来自不同生态系统的许多不同细菌和真菌产生不同类型的铁载体。目前，有近500个铁载体来自于选定的微生物。从一个物种到另一个物种，铁载体结构有很大的变化。^3.本研究是从铁厂土壤中分离的细菌生产铁载体。

材料和方法

样本收集和细菌分离

使用无菌聚乙烯覆盖物从Kanchipuram铁工业区采集土壤样本。用标准扩散板法从采集的样品中分离细菌。选择形态不同的菌落，继代培养，并在4℃的营养琼脂斜面上保持⁰C直到进一步筛查。

筛选和生产剑道

筛选所有细菌分离株，用于通过铬Azurol S（CAS）方法产生的施工电池。⁴所有的玻璃器皿都在6nhcl中浸泡了一夜，并用蒸馏水冲洗几次以去除铁的痕迹。新鲜培养的细菌接种在CAS琼脂板上，在28℃培养⁰C持续24-48小时。培养后，通过在CAS琼脂平板上的孔周围存在橙色区域来确认铁载体的产生。

将来自营养琼脂平板的新鲜生长的细菌细胞接种到补充有300µg FeSo4的Fiss葡萄糖最低培养基中，并在旋转振动筛中保持24小时。整个培养基在5000 rpm下离心10分钟，并将无细胞上清液收集在无菌螺旋盖管中。将约100µl的CFS装入在CAS琼脂板上制成的5 mm大小的孔中。同时添加无菌培养基作为对照，并在室温下培养平板。在所测试的两个菌株中，选择颜色变化最大的菌株SD12作为进一步研究的潜在菌株。

Siderophore打字： 羟肟酸铁载体的检测（四唑测试)

本试验的依据是羟肟酸在强碱存在下通过羟肟酸基团水解还原四唑盐的能力。在CFS中加入四唑盐和氢氧化钠后立即出现深红色被认为是羟肟酸铁载体的存在。⁵

儿茶酚酸铁载体的检测(阿诺氏试验)

儿茶酚酸铁载体与亚硝酸、钼酸盐和碱依次反应，产生在515 nm处吸收最大的粉红色显色剂。⁶

羧酸铁载体的检测(分光光度法)

羧酸铁载体是通过形成铜络合物来检测的，铜络合物在190-280 nm之间存在最大吸收。铜络合物被吸收的波长没有特定的规律。扫描整个波长190 -280 nm，观察铁载体的吸收峰。⁷

选择培养基对铁载体产生的影响

将菌株SD12的10%接种物转移到按照Rachid的建议以三种不同成分制备的King B培养基中等．⁸将所有烧瓶在旋转振荡器中孵育4天。孵育后，收集CFS（粗助剂）并通过如前所述的CAS测定确认过施胶的存在。使用6M HCl将细胞自由上清液酸化至pH2，并用乙酸乙酯三种乙酸乙酯萃取。将乙酸乙酯级分合并在一起并使用旋转真空蒸发器浓缩。用粗制散剂量量化并储存在-20⁰C。⁹

铁载体的部分纯化

通过使用饱和硫酸铵溶液沉淀分离CFS中存在的铁载体。沉淀蛋白中的盐通过透析去除。进一步测试透析液的铁载体活性和分型。采用标准SDS-PAGE分析法测定部分纯化透析液的分子量。

铁载体的抗真菌活性

部分纯化铁载体的抗真菌活性通过Schorth和Hancock描述的方法测定。¹⁰本研究中使用的试验生物包括镰刀菌属、曲霉属,藻属通过良好的扩散方法。在28小时孵育72小时后测量抑制区⁰C。

电位应变的表征

采用标准微生物学方法研究了潜在菌株的微形态、克氏反应、内孢子存在、运动性、培养特性、酶活性等表型特征。在属水平上，通过与《Bergeys系统细菌学手册》中已知细菌种的特征进行比较，确定了潜在菌株。

结果与讨论

共回收12个形态不同的菌落（SD1-SD12），用营养琼脂培养基进行纯化和继代培养。在CAS分析中，只有两株菌株SD6和SD12对铁载体产生呈阳性反应（橙色区域）。菌株SD12在CAS板中产生最大15mm大小的橙色区域。CAS分析⁴是用于施工电影检测的通用化学品测定，并基于对铁铁的高级亲和力。CAS板颜色为蓝色，因为铬紫罗酚S染料是用铁铁的复合物。当存在施手的时候，发生以下反应，释放自由染料，其颜色为橙色。

在Xieredophore键入中，菌株SD12的无细胞上清液（粗助剂）在四唑鎓试验中产生深红色。该结果证实，由菌株SD12产生的阳光是羟肟酸酯类型。羟肟酸盐纵横道由细菌和真菌产生。最羟肟酸酯基团，C（= O）N-（OH）R，其中R是氨基酸或衍生物。每种羟肟酸盐组提供两个氧分子，其与铁形成二齿配体。因此，每个施胶团与Fe3 +形成一份六型八面体络合物。羟肟酸盐施氏细胞通常在与熨斗结合时显示出425和500nm之间的强烈吸收。用真菌产生的铁蛋白黑粉菌属sphaerogena，是第一个被隔离的铁道，并显示为其他微生物的生长因子。¹¹通过进一步的光谱和色谱分析证实了由菌株SD12产生的羟肟酸盐施胶中存在的官能团。鲍威尔等．¹²已经表明，羟肟酸盐施在各种土壤中存在，它们也在水生环境中产生。重质金属的进一步过度积累对大多数植物有毒，并污染土壤，导致土壤微生物活性和土壤肥力降低，产量损失。¹³在这方面，土壤中存在的异羟肟酯型铁载体在固定金属方面起着重要作用。

在三种不同的培养基中，由培养基3产生的粗铁载体最大为25 mm的橙色带。硫酸铵沉淀后得到粗蛋白沉淀420 mg/ml左右，透析后得到部分纯化的铁载体190 mg。根据SDS page分析结果，与标准标记蛋白比较，菌株SD12产生的铁载体分子量为70 ~ 80 KDa。

铁载体本身是各种植物病原真菌的生长抑制剂，如疫霉parasitica, ¹⁴ 植物Ultimum. ¹⁵和尖孢镰刀菌. 建立了直接相关性体外在荧光假单胞菌的施用中合成及其抑制衣原体的萌发的能力F尖孢菌。 ¹⁶在抗真菌活性测试中，部分纯化的铁载体抑制植物真菌病原体的生长，例如茄镰刀菌，黑曲霉和Phythium sp。(图1)

图1：羟肟酸酯的抗肺腺嘌呤活性 由细菌菌株SD12产生的铁载体。 点击这里查看图

本研究分离的潜在菌株SD12为革兰氏阳性杆状、孢子型、活动菌。过氧化氢酶和硝酸还原酶呈阳性，氧化酶呈阴性。根据所研究的特性(表1)，菌株SD12鉴定为芽孢杆菌SD12 sp。许多作者报道了铁载体的产生和抗植物真菌活性芽孢杆菌sp．Pankajkumar.等．¹⁷据报道，从根际土壤中分离的芽孢杆菌菌株的施工，植物植物活性和其他植物生长促进性能。Bharucha.等．⁹（2013）报告了儿茶酸盐型施工电池的抗真菌活性芽孢杆菌根际土壤中分离的SpMedicaco漂白亚麻纤维卷(紫花苜蓿)．根据SD12的分子特征，在物种水平上对其进行鉴定。

表1：表型特征 潜在菌株SD12 点击此处查看表格

本研究的结果表明，潜在的芽孢杆菌本研究中鉴定的SP SD12是用于生产羟肟酸盐的潜在候选者。从菌株SD12铺平了施用方法的进一步纯化和表征在医学和农业领域的利用。

确认

作者感谢Kanchipuram Sri Sankara文理学院的校长和管理人员提供的研究设施。

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