当前世界环境

介绍

自由活固氮细菌被认为是促进植物生长的无机氮肥的替代(Ladha和Reddy, 2000;公园等, 2004)。尽管已经从各种作物的根际分离出了多种固氮细菌，但由于它们作为生物肥料的潜在用途，最近对分离更有益的植物生长促进细菌的兴趣有所增加(Vessey, 2003)。栽培稻种(Oryzasativa)起源于野生稻种，并在几千年前被驯化(星川，1989;奥卡河,1988;肯尼迪等。，2001）。野生稻种可能含有独特的氮素固定细菌种群，这些细菌不同于培养稻的广泛繁殖的现代品种（Hurek等，2000）。植物激素的生产（Tien等。，1979年;哈哈特拉等.， 1990)和植物病原菌的竞争抑制(Glick, 1995, Park .等.， 2004)是这些微生物对植物的有益影响。南阿萨姆邦的农业土壤经历了每年的强降雨，导致养分流失，给农民造成了经济损失(Anonymous, 2007)。生物肥料的使用可以替代化肥，实现可持续的水稻种植，同时提高水稻-农业生态系统的生产力。

本研究旨在从印度南阿萨姆邦不同微生境的水稻本地品种根际中分离、鉴定重氮营养细菌，并对其进行分子特征分析，研究其固氮和促进植物生长的活性。

材料和方法

细菌生长媒体

Burk的无培养基包括：10g葡萄糖，0.41g kh₂阿宝₄，0.52g Na.₂所以₄, 0.2 g CaCl₂, 0.1 g MgSO₄.7h.₂o，0.005g feso₄.7h.₂啊,0.0025 g Na₂MoO₄.2H.₂在整个研究中使用了半固体和15g琼脂的1,18g琼脂（所有每升蒸馏水）（威尔逊和骑士，1952）。在121的高压灭菌前将培养基的pH调节至7±0.1⁰c为15分钟

土壤样品的采集和重氮营养物的分离

随机选择了在南阿萨姆的喀里莫工区不同微藻中生长的10种土着水稻品种。从0-5cm的深度拔除林植物，用于脱菱晶虫取样。然后将样品立即置于灭菌的塑料包中，并密封到实验室并储存在4的温度下^oC.将根际土壤样品10克转移到装有90ml无菌蒸馏水的250ml Erlenmeyer烧瓶中，摇匀(120rpm) 30min。连续稀释0.1ml (10^3.-10⁵)被涂在含有伯克氏无氮培养基的盘子上。30℃培养7 d⁰C.分离出现在培养基上的形态学不同的菌落，并培养以进一步分析。

图1:从NCBI获得的菌株KR-23、KR-4、KR-6、KR-16、KR-7的16S rDNA序列及相关序列分析得到的系统发育树。比例尺，每个核苷酸位置0.02次替换 点击这里查看图

细菌分离株的表型表征

根据Bergey系统细菌学手册中描述的方法检查细菌分离株的生理和生化特征（HOLT等, 1994)。观察各菌株菌落的颜色、色素、形态、直径、海拔、边缘、表面、不透明度和质地。运动和形态检查的帮助，相差显微镜。革兰氏反应按标准方案进行。采用平板法测定分离菌株的淀粉水解、碳源利用。同时进行MR-VP试验、吲哚试验、尿素水解试验。

16S rDNA基因扩增与测序

使用标准细菌程序获得基因组DNA (Sambrook et al.， 1989;公园et al ., 2004)。用氯仿对裂解液进行两次萃取，以去除残留苯酚。用于16s核糖体DNA PCR扩增的引物为27F (5^一个ˆ•-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3^一个ˆ•）和1492r（5^一个ˆ•-tacggttaccttgttacgactt-3.^一个ˆ•) (Weisberg等人，1999)。每个PCR混合物(50µl)包含引物(浓度为20pmol)、dNTP (Promega Co.， Southampton, England)混合物(浓度为200µM)、Taq聚合酶缓冲液、染色体DNA (ca 100ng)和酶(4µl)的混合物。热循环条件包括在94℃的初始变性步骤⁰C孵育4min, 35个扩增周期为94⁰C持续1分钟，58分钟⁰C 1分钟和72分钟⁰C 3分钟，最后延长72步⁰用Gene-Amp PCR系统(Perkin-Elmer Co.， Norwalk, Conn.)孵育10分钟。PCR产物在0.7%琼脂糖凝胶上运行并显示。采用ABI PRISM 310基因分析仪(PE Applied Biosystems, Foster City, CA)和大染料终止循环系统(PE Applied Biosystems)进行PCR直接测序，确定16S rDNA核苷酸序列。相关序列来源于美国国家生物技术信息中心(NCBI) Genebank数据库，使用BLAST, Version 2 (Altschul et al.， 1990;公园et al ., 2004)。用Clustal W软件对序列进行比对并计算一致序列。利用Neighbor-Joining法(Saitou N et al.， 1987)推导了进化历史，利用最大复合似然法计算了进化距离(Kumar S等.， 2004) MEGA版本5(库马尔等, 1993)。

表1：水稻植物根际不同分离株的植物源，分离数，位置和乙炔还原测定。 点击此处查看表格

乙炔还原测定(ARA)

采用半固态无氮苹果酸盐培养基(采用乙炔还原法(ARA;哈代等．1973)。将纯菌落接种于容量为10ml的McCartine瓶中的NFM培养基上，在28±2℃下孵育48 h。瓶中注入10% vol/vol的乙炔气体。在28±2°C孵育16 h后，气体样品(100 μl)在惠普气相色谱仪(HP 6890型，美国)上使用Porapak-N柱和H2火焰离子化检测器进行分析。ARA处理完成后，加入10% SDS对细胞进行简单的超声处理。混合悬液中的蛋白质浓度用劳瑞法测定。(洛瑞等, 1951)。

吲哚-3-乙酸生产

分离菌株在添加l -色氨酸(100mg/l)的伯克氏培养基中生长，以30⁰C.固定相培养物10000rpm离心15min获得培养液上清，用1N HCL调节pH至2.8。酸化培养物中的生长素用等量的乙酸乙酯萃取(Park等, 2004;天山等。，1979）蒸发至干，并重新悬浮在4ml乙醇中。使用UV检测器在Nova-Pak 5-ODS C-18柱上通过HPLC（水系列474，USA）进行样品的分析。甲醇：乙酸：水（30：1：70 v / v）用作0.6mLmin的速率作为流动相^-1(拉苏尔等。，1998）。纯吲哚-3-乙酸（Sigma USA）用作标准。通过将保留时间，峰值区域和紫外光吸收光谱与使用计算机连接的界面（水域）的界面（水域）与标准的标准进行比较来定量样品的IAA。

磷溶解

p的溶解试验是在Goldstein(1986)之后进行的。30℃时菌落生长96h后，菌落周围出现清除区⁰C被用作P-溶解的指示剂。用热杀死细胞接种的平板作为对照。

ACC脱氨酶活性

ACC脱氨酶活性按Glick描述的方法测定等, 1995年。为此，每个LB纯细菌培养物1µl接种到含NFb或添加1-氨基环丙基-1-羧酸盐(5.0 gl)修饰的NFb- acc琼脂平板上^-1)作为独特的氮源。培养皿在28℃培养⁰C，每天观察菌落形成，持续4天。菌落再次接种，在相同的实验条件下孵育。在添加ACC的NFb中新形成的菌落被认为ACC脱氨酶活性阳性。

统计分析

使用SAS包，版本8.2（SAS，2001），对测量结果进行差异（ANOVA）的分析。

表2:生化特性 真正的营养孤立株 点击此处查看表格

结果

不同群体的二位素的分离和鉴定铺平了降低无机N-肥料的成本和使用的方法，并尽量减少了从化学肥料的应用中的农业生态系统污染的风险。以前关于氮素固定细菌分离的研究表明，与不同作物根际相关的重氮化多样性多样化（船舶，2003）。多样的自由生活或联想₂-固定微生物(好氧菌、兼性厌氧菌、异养菌、光养菌)生长于湿地稻田，对土壤n有贡献。在Burk无氮培养基上共分离出25株游离固氮活性细菌。分离菌株经纯化后在无氮固体培养基上继代培养。

还原乙炔的能力是固定氮势的指标，是监测功能固定氮势的特异性指标(Andrade)等。，1997）。在25个分离物中，选择11的氮固定效率，具有ARA活性，IAA活性和ACC脱氨酶活性。在所有菌株KR-23中，表现出最高的氮化活性（300 Nmolc₂H₄h^-1米^-1蛋白质)。

生化特性表明，所有菌株均为革兰氏菌，具有运动棒，具有不同的代谢活性。所有菌株的生化特性见表2。

从16S开始的菌株的序列分析观察到，在KR-4的16S rDNA序列之间观察到百分之九十九个序列同一性Pseudomonas普蒂达；KR-23和KR-5Spingomonasazotifigens；KR-6与StenotrophomonAsamaltophila.；KR-16与Herbispirillum sp．KR-7与Herbispirillumrubrisubalbicans, KR-28克雷伯氏菌肺炎, K15Pantoeaagglomerans, KR-34Acinetobacterradioresistance，KR-18与Enterobactercloaceaesubspdissolvens，KR-8与Alcaligenesfaecalis和KR-20achromobacterxylylyans。许多工作人员已经从不同的作物中分离出了上述所有细菌(Bhromsiri等。，2010;SA等．2009;乌雷塔等。，1995年;GOLYMI.等, 2009;谢等。，2006）。在图1中提出了反映从NCBI数据库中获得的菌株和候选序列之间关系的诸如培养基和候选序列之间的该阶级图。获得的序列与登录号KR-4：JN222977，KR-23：JN085438，KR-5：JN085437，KR-6：JN085439，KR-16：JF990839，KR-7：JF906701，KR-28：JN162393，KR-8：JN162397，KR-20：JN162396，KR-15：JN162392;KR-34：JN162392，KR-18：JN162395。

讨论

促进robobacteria的植物生长提供了一种环境可持续的方法来增加作物生产和健康。微生物的IAA生产和ACC脱氨酶活性有助于刺激植物的生长和发病机制。在这项研究中，所有11个菌株产生了相当数量的IAA，也能够与不同工人的各种细菌的早期研究相当的ACC脱氨酶活性（Malik等, 1997;Sucksstorff和Berg, 2003年;公园等, 2004;谢等。，2006）。ARA和IAA活性的量和ACC脱氨酶活性的能力如表1所示。在所有分离物中鞘玉米碱血清毛虫，普蒂达萨，Pantoeaagglomerans，肠杆菌酸胚层。溶解，Klebsiellapneumoneae和海草Sp能溶解磷。

本研究报告了菌株的分离和表征S.azotifigens.，嗜麦芽s.p eltophila,P. putida, Herbispirillum sp.， H.rubrisubalbicans,P.agglomerans，A.xyloxidans，一种辐射侵蚀剂，A.粪群，E.亚克酸亚普。溶解和K.Pneumoneae来自南阿萨姆水稻农业生态系统根际土壤的无机肥，证实了其固氮潜力。

Sphingomonasazotifigens在我们的研究中，首次在印度阿萨姆邦南部的稻田报道。11株菌株均能产生IAA，具有ACC脱氨酶活性，其中部分菌株具有p溶解作用。的隔离恶臭假单胞菌，鞘氨氮单胞菌，草食菌属并且在早期的研究中被认为是PGPR (Gholami, 2009;公园等, 2004;Baldani.等, 2009),但是StenotrophomonAsamaltophila.和Herbispirillumrubrisubalbicans，作为IAA的生产者，并且能够产生ACC脱氨酶，在我们的研究中也是首次报道。在许多早期的研究中，这两种细菌被报道为病原菌和内生菌(Reinhardt)等。，2008;丹顿等.1999;黑尔等, 1972;吉利斯等。，1990）。需要增加这些分离物在盆栽文化下植物生长促进中的作用的知识，并且是植物生长促进无根茎的植物生长。

确认

作者感谢生命科学系，萨姆姆大学（Silchar），印度，提供实验室展望。

参考

1. 作者简介:alschul s.f.， Gish W.， Miller W.， Myers E.W. and Lipman d.j.， J. Mol. Biol。， 215, 403(1990)。
2. Andrade G.，Esteban E.，Velascol L.，Maria J.L.和贝马尔E.J.，植物土壤197,19（1997），http://dx.do.org/10.1023/a:1004211909641
3. Baldani I.J.和Baldani L.V, Anais Da Acad. Brasiliera De Ciencias Sci。， 77,549 (2005)， http://dx.doi.org/10.1590/S0001-37652005000300014
4. brosiri c和brosiri A。科学。，43.(4), 239 (2010).
5. 谢承辉，谢横田，黄志强，黄志强，黄志强
6. 丹顿和克尔，克林。微生物。Rev. 11,57(1998)。
7. Reinhardt E. L., Ramos P.L., Manfio G.P., Barbosa H.R., Pavan C. and Carlos A. Moreira-Filho C.A., Brazilian Journal of Microbiology, 39, 414 (2008), http://dx.doi.org/10.1590/S1517-83822008000300002
8. Gholami A.， Shahsavani S.和Nezarat S.，世界科学、工程和技术研究院49(2009)。
9. Gillis M.，Dobereiner J.，Pot B.，Goor M.，Falsen E.，Hoste B.，Reinhold B.和Kersters K.在M.Polsinelli，R. Materassi和M. Vin-Cenzini（Ed。），氮固定。Kluwer Academic Publisher，Dordrecht，然后。293（1990）。
10. GLICK B.R.，CAN。J. microbiol。41,109（1995），http://dx.doi.org/10.1139/m95-015
11. Goldstein A.H.，AM。J.改变。农业。，1,51（1986）。
12. Gyaneshwar P.， James E.K, Mathan N.， Reddy P.， Reinhold B.， Hurek and Ladha。j . Bacteriol。，183, 2634 (2001), http://dx.doi.org/10.1128/JB.183.8.2634-2645.2001
13. Haahtela K.，Konkoo R.，Laakso T.，威廉姆斯P.H.和莫尔的Korhonem T.K.。植物微生物互动。，3,358（1990），http://dx.doi.org/10.1094/mpmi-3-358
14. Hale c.n.和Wilke J.P, J. Agric。Res, 15448(1972)。
15. 《植物生理学》作者:哈代、霍尔斯滕、杰克逊。(1968)。
16. Holt J.G.，Kreig N.R.，Sneath P.H.A.，Staley J.T.，Williams S.T.，威廉姆斯和威尔金斯，美国巴尔的摩（1994）。
17. 《水稻植物科学》，第1卷．形态, 339年。东京:粮食和农业政策研究中心(1993年)。
18. 肯尼迪I. R.，Choudhury A.T.M.A.和KecskésM.L.，土壤生物学和生物化学杂志，36（8），1229（2004），http://dx.doi.org/10.1016/j.seilbio.2004.04.006
19. Ladha，J.K.和雷迪，下午，探讨稻米氮固定。1999年8月9日至12日，9-12，Irri，Los Banos，Laguna，菲律宾，354（2000）的第三次工作组第三次工作组会议议程会议。
20. Lowry H.O.，Rosebrough N.J.，Farr A.G.和Randall R.J.，J. Biol。化学。，193,265（1951）。
21. Park M.， Kim C.， Yang J.， Lee H.， Shin W .， Kim S.， Sa T.，微生物研究160,127 (2005)，http://dx.doi.org/10.1016/j.micres.2004.10.003
22. Oka，H.I ..栽培稻的起源．东京:日本科学学会出版社(1988)。
23. 拉索尔G.， Mirza M.S.，拉提夫F.和马利克K.A.， Kluwer学术出版社，荷兰，25(1998)。
24. SAS, Institute Inc.， SAS用户指南，版本8.2。美国北卡罗来纳州凯里的SAS研究所(2001)。
25. 赛图和聂敏，孟碧娥。另一个星球。，4，406 (1987).
26. Shahi S.K, Rai A.K, Tyagi M.B, Sinha R.P.和Kumar A.，非洲生物技术杂志，10(42)，8296，(2011)。
27. Suckstorff I.，Berg G.，J. Appl。Microbiol。，95,656（2003），http://dx.doi.org/10.1046/j.1365-2672.2003.02021.x
28. Tien T.M.，Gaskins M.H.和哈贝尔D.H.，Appl。环境。Microbiol。，37,1016（1979）。
29. (1)《植物土壤》，2004年第1期，第1 - 2页，http://dx.doi.org/10.1007/BF00011329
30. 《植物生态学报》2003年第1期，第2 - 3页，http://dx.doi.org/10.1023/A:1026037216893
31. 魏斯伯格、巴恩斯、佩尔蒂埃和连d.j. J. J.细菌学杂志(1991)。
32. 威尔逊P.W.和骑士S.C.，Burguess，Minneapolis，USA，49（1952）。