当前世界环境

介绍

甲醛是化工工业中广泛应用的一种重要的中间化合物。它经常出现在废水和废气中，造成普拉多环境污染et al .,(2003)。甲醛还用于木材、造纸、皮革、树脂和胶水的工业加工(克里克)et al .,(1980))。甲醛以单体(自由)形式存在于废水中，以及它的衍生物如醚、尿素、酚缩合物，还可以与树脂、酚和许多其他化学物质形成复合复合物。大多数甲醛衍生物是在化学工业过程中作为废物或副产品产生的，它们比游离甲醛更不容易被生物降解。

甲醛由于具有杀菌作用，常被用作防腐剂和消毒剂中抑制微生物活性的活性成分。它是一种高度活性的有毒化合物，可对生物体产生严重的作用。尽管甲醛具有杀微生物活性，但甲醛作为唯一的碳和能量来源被甲基营养微生物吸收，是甲醇氧化过程中的关键代谢中间体。Bonastreet al .,(1986)报道了在2300mg /L的活性污泥中甲醛的部分生物降解。Adroeret al .,(1990)报道,假单胞菌putidaA2降解400 mg/L甲醛作为批量研究的唯一碳源。

对甲醛降解的研究也很少假单胞菌(加藤et al .,(1983),濑进et al .,1995)埃希氏杆菌属杆菌(Gutheilet al .,(1997)，各种菌株阿特伍德和奎尔(1984)，Hansenula sp。卡西克，克洛泽克(2000)和Trichosporumsp。金子(1985)。Azachiet al .,(1995)发现Halomonassp. MA-C可在盐介质中降解75-100 mg/L甲醛，并通过NAD-和谷胱甘肽依赖性甲醛脱氢酶快速转化甲醛。山崎et al .,(2001)研究了从沿海海水中分离的一株抗甲醛细菌DM-2对甲醛的生物降解作用。甲醛预培养的DM-2菌株在3% NaCl的无机培养基中完全降解400 mg/L的甲醛。绅士等al。(2002)报告甲醛去除合成介质和工业废水红球菌属erythropolisUPV-1。

在含盐废水中，甲醛排放来自不同的行业，如酚醛树脂制造行业(Cvetkovic et al 1988)和脲醛胶粘剂行业(Vidal)et al .,1999)。甲醛在非嗜盐条件下进行生物降解，而基质在嗜盐条件下的生物降解尚未见报道。本文报道了从含盐环境中分离出的耐盐菌群，用于降解甲醛。

材料和方法

细菌联合体和培养条件

该菌群是从钦奈不同生境的土壤样品中分离出来的，邻近盐环境。在初始适应期，该菌体富含酚类化合物，并进行了生物化学表征，共6株菌，其中4株为革兰氏阳性菌，2株为革兰氏阴性菌。通过16S rRNA基因序列分析，鉴定6株分离株为蜡样芽孢杆菌，节杆菌属，芽孢杆菌地衣菌，盐单胞菌，枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌。的序列分别为EU780459、EU780460、EU780461、EU780462、EU780463和EU780464。

在甲醛富集过程中，以100mg/L甲醛作为唯一的碳源和能量源进行驯化。在g/L NaCl(30.0或50.0或70.0,KH)的无机盐培养基中富集₂阿宝₄0.25, NH₄Cl 1.0, Na₂薄₇2.0, FeCl_3.0.0125, CaCl₂0.06和MgCl₂0.05。培养基中添加一定量的NaCl和10 mg酵母提取物，调整pH为-7 (Alva和Peyton 2003)。介质经高压灭菌，冷却至室温，在250ml Erlenmeyer烧瓶中通过0.45µm无菌过滤器加入甲醛(100mg /L)。研究中使用的化学试剂为分析级。

甲醛的生长与降解

通过测定在营养琼脂培养基上每毫升菌落形成单位(cfu)来研究细菌在甲醛上的生长。用100-400 mg/L的不同浓度的NaCl(1%、3%、5%和7%)和甲醛替代矿物介质。首先在培养基中添加100mg /L的底物，从5ml等量的底物无菌接种到100ml添加甲醛浓度增加的液体培养基中。每隔24h, 10000 rpm离心15分钟，去除细胞。收集培养上清液用于测定甲醛残留量。

对甲醛降解

降解甲醛的不同条件为(i)培养基+甲醛+细菌联合体(ii)培养基+甲醛和(iii)培养基+细菌联合体，(ii)和(iii)作为对照。在培养液中加入浓度为10⁴- 10⁵cfu /毫升。培养物一式两份，37°C孵育，150 rpm摇瓶，每隔24 h提取一次，连续5天。

测定甲醛

甲醛测定采用Hatzsch法(Nash 1953, Doromina)et al .,1997)。取5毫升培养样品与等体积Hantzch试剂(2m醋酸铵、50mM醋酸、20mM乙酰丙酮)混合，60℃孵育10分钟。在412 nm处测量得到的黄色

气相色谱法测定苯酚

用气相色谱法测定苯酚的含量。细胞悬浮液通过离心(10,000 rpm for 15 min, 6°C)澄清。培养上清用二氯甲烷提取，冷凝并通过0.2mm的格尔曼过滤器过滤，然后在配备FID检测器的气相色谱仪(chemto GC Model No 1000)和毛细管柱(Varian Chromopak毛细管柱CP SIL 8 CB, 30m X 0.32 mm)中进行分析。氮气为载气，进样温度220℃，检测器温度250℃，柱温保持在150℃。

pH、盐和氮源的影响

以100mg/ L甲醛为菌体，在5% NaCl条件下，考察了不同pH(6,7和8)对菌体生长的影响。培养基中添加酵母膏(0.01%)、胰蛋白胨(0.01%)和尿素(0.01%)等不同氮源。通过添加5%的单盐(氯化钾、钠)，研究了不同盐对甲醛生物降解的影响₂所以₄K₂所以₄和纳米_3.

Co-Substrate效果

为研究共底物的影响，以100 mg/L的苯酚和100 mg/L的甲醛为共底物，在5% NaCl条件下考察了其降解效果。

结果与讨论

不同NaCl浓度对甲醛的降解

利用从盐渍土壤中富集的6株菌组成的菌体降解甲醛。考察了在不同盐浓度(1%、3%、5%和7% NaCl)下，该联苯对甲醛(100mg /L)的降解能力。培养基的盐度影响甲醛的降解，以5% NaCl为最佳条件。当矿物介质盐度增加到7%时，甲醛去除率降低。财团的规模从4倍增长到10倍^3.7 x 10⁷在NaCl浓度为5%的情况下，甲醛在96 h内完全降解。不同NaCl浓度下菌团的生长情况及对甲醛(100 mg/L)的降解效率如图1所示。

早期的研究使用单个菌株来降解甲醛(加藤et al .,(1983)，阿特伍德和奎尔(1984)，阿扎奇et al .,(1995), Doroniaet al .,(1997),范Dijikenet al .,(1975)， Pilat和Prokop，(1976)，其中甲醛浓度低于400 mg/L，并在非盐水条件下进行。在本研究中，我们使用了一个细菌联合体来研究不同NaCl浓度(1%、3%、5%和7%)下甲醛的生长和利用。在100mg /L甲醛和1% NaCl溶液中，对数相cfu/ ml为7 × 10^3.，最低去除率为31%。在3% NaCl条件下，降解率为87%，细胞数约为8 × 10⁶当NaCl浓度为5%(97%)时，96 h降解最大，细胞数量增加7 × 10⁷没有任何滞后阶段。当NaCl浓度增加到7%时，降解效率降低到38%，细胞数减少到6 × 10⁴结果表明，在NaCl浓度为5%以上时，该体系不能有效地矿化甲醛。从海水中分离的DM2菌株仅能利用甲醛(200mg/L)， NaCl浓度为3% Yamazaki et(2001)。Azachiet al .,(1997)报道了甲醛(75-100 mg/L)的降解Halomonas在盐浓度下生长的0到20%。在本研究中，甲醛的降解仅在NaCl存在的情况下实现，当NaCl浓度为1%时，仅实现了最低程度的降解(31%)，这证明了该联合体在甲醛上生长需要盐。因此，该菌群中的菌株在自然界中具有中度嗜盐性。

不同浓度甲醛的降解

先前的实验证明，该菌群在5%的最佳盐度下能够生长。因此，对其在高浓度甲醛下的生长能力进行了研究。当甲醛浓度为200 mg/L时，降解率为82%，生长速度为7 × 10⁶在96 h内，当浓度增加到300 mg/L时，当细胞数为5 × 10时，降解率降低到75%⁵当甲醛浓度为400 mg/L时，细胞计数为6 × 10时，效率仅为62%⁴(图2)。先前的报告显示了这一点假单胞菌putida菌株A2在100h内使用400 mg/L甲醛(Adroeret al .,(1990))。Azachiet al .,(1995)隔离Halomonas使用高达75-100mg/L甲醛的MAC菌株。Lu和Hegemann(1998)报告称，在甲醛浓度200或400 ppm以下，>90%的甲醛通过厌氧污泥培养20 d可降解。

山崎et al .,(2001)从海水中分离出一株抗甲醛细菌(命名为DM-2)，在3% NaCl条件下可降解200mg /L甲醛(20h后甲醛残留70%)。当甲醛浓度增加到400 mg/L时，去除率降低到45%。

图1:甲醛的降解 (100 mg/L) (a)细菌联合体的生长和(b)细菌联合体的降解 点击这里查看图

很少有个别菌株降解甲醛的报告，其中400 mg/L浓度的细胞使用假单胞菌putida在100小时(Adroeret al .,1990)。HalomonasDSM(7328)可使用75-100 mg/ L， (Azachi等al。1995)、大肠杆菌(Gutheilet al .,1997),不能对甲醛的耐受性高于20 mg/L。在我们的研究中，在96h的盐水条件下，细菌联合体能够去除63%的甲醛(400mg/L)。

甲醛的代谢要么通过甲醛脱氢酶或甲酸脱氢酶的顺序作用，要么通过基于单磷酸核酮糖循环的酶的循环途径(Azachi)et al .,1995)。因此，在生理盐水条件下甲醛降解过程中所涉及的酶的研究将成为今后的研究方向。

图2:不同浓度的甲醛在5% NaCl下的降解(a)生长和(b)菌团在5% NaCl下的降解 点击这里查看图

图3:pH (a)、氮源(b)和盐对降解的影响在5% NaCl条件下，细菌联合体测定甲醛 点击这里查看图

图4:共底物苯酚对甲醛(100mg /L)的降解(100mg/L) 点击这里查看图

pH、氮源和盐的影响

该菌团在3 ~ 7% NaCl浓度下均能降解甲醛，但在5% NaCl浓度为100mg/L时降解效果最佳。研究了最佳pH、氮源和共基质苯酚对甲醛(100mg/L)的降解效果。

pH值的影响

在pH为6到8的条件下，菌体可以生长(图3 (a))。在pH为7的条件下，96 h的降解率最高，达96%。pH为8时降解率约为80%，pH为6时降解率进一步降低至42%。

氮源效应

这表明，嗜盐菌在高盐浓度下有更高的营养需求，因此，含有生长促进因子的复合培养基可能有助于在高盐浓度下促进嗜盐菌的生长(Orenet al .,2002)。我们的研究还评估了低浓度酵母提取物、胰蛋白胨和尿素的效果(图3 (b))。以酵母膏为氮源时，胰蛋白胨为84%，尿素为74%，最大降解率为96%。在5% NaCl和pH-7.0条件下，0.01%酵母浸膏对甲醛的最大降解量为100 mg/L。卡拉也得到了类似的结果et al .,(2004)耐盐细菌在好氧条件下降解BTEX化合物的研究Marinobacter在酵母提取物存在的情况下，能在8天内降解苯。从盐沼中分离到的一株古菌(EH4)能够降解较高比例的二十烷(C_20.H₄₂)，在酵母提取物，蛋白胨和Casamino Acids (Bertrandet al .,1994)。

盐的影响

工业废水除了氯化钠外，还含有许多其他盐;因此，在盐的条件下研究了不同盐对甲醛降解的影响。图3 (c)显示了不同盐对甲醛的去除效果。分离的联合体能够在不同的盐和NaCl的存在下生长。在钠的存在下，甲醛的去除率约为76%₂所以₄在盐水条件下。氯化钾和钾₂所以₄甲醛降解率分别降至63%和67%。但在纳米粒子的存在下，细菌联合体的降解率最低，为54%_3.．这与王的结果是一致的et al .,(2009)，他们研究了盐对苯酚-甲酚混合物降解的影响。Na₂所以₄与KCl、K等盐类相比，其去除率达90%以上₂所以₄．

Co-Substrate效果

酚醛树脂生产废水中含有苯酚和甲醛两种主要成分。大量的文献报道了在非盐水条件下苯酚或甲醛的降解。然而，研究苯酚和甲醛的混合物在盐水条件下的降解是很有趣的。因此，在本研究中，我们尝试在盐水条件下同时检测苯酚和甲醛的降解。在研究过程中，甲醛的降解并没有干扰苯酚的降解，如图4所示。在100 mg/L条件下，对甲醛的降解率为96%，对苯酚的去除率为99%。这与Eiroa的工作是一致的等al。(2005)显示甲醛在反硝化条件下，去除不受苯酚存在的影响。

结论

本工作证明了分离的consor tium在不同盐浓度下对甲醛的降解，其中在5% NaCl下降解效果最佳。该体系可降解高达400mg /L的甲醛，并可矿化苯酚作为共底物。据我们所知，这是第一次在不同浓度的NaCl条件下，以苯酚为共底物，利用细菌联合体降解甲醛。由此推测，分离菌群在高盐环境含甲醛和苯酚废水的修复中具有潜在的应用价值。

参考文献