当前世界环境

介绍

蓝藻产生的藻华对下层有遮阳作用，导致表层以下呼吸活动增多，动物窒息。^1,2一些淡水藻类微囊藻、小球藻、滴虫和Phormidium是有害的，因为它们产生的生物质会产生难闻的气味，导致脱氧和破坏水生生物。^3.某些种类的微藻过度生长，特别是微囊学和螺旋藻导致水中缺氧。Phormidium已知绽放通过在盐水上赋予红颜色和不良气味来破坏盐，它也会凝聚盐水，从而无法盐水溶液结晶到盐中。⁴在农业中，这些水不能用于灌溉、农场动物的饮用水和作物加工。^5、6开花还会产生一种叫土臭素的物质，产生难闻的气味，使水无法用于家庭和娱乐。⁷由于土臭素和甲基异角藻(MIB)会给鱼带来不良的味道，蓝绿藻常与鱼的异味问题联系在一起。^8、9藻华还与被称为蓝藻毒素的有害小分子的产生有关。蓝藻毒素在水生食物链中积累，对整个营养层次的水生生物构成严重威胁。¹⁰人类和其他陆生生物接触蓝藻毒素是由于摄入了受这些毒素污染的饮用水，尽管人类在食用组织中积累的蓝藻毒素含量较高的海鲜后也可能接触到蓝藻毒素。霍格兰进行的研究等等。，（2002）表明，用蓝藻产生的微生钛素可以生物累积在海鲜中，随后在他们最终饲养海鲜食物时会导致人类中毒。^11，12研究进一步表明，不同的蓝藻细菌产生不同的蓝藻毒素，对人体有不同的影响Aphanizomenon flos-aquae它会产生一种叫做蛤蚌毒素的氰化物，这种毒素会导致瘫痪性贝类中毒。^13，14Anabaena Flos-aquae产生一种称为anaToxin的神经毒素，影响神经突触。¹⁵Lyngby amajuscula产生一种叫做脱溴藻毒素的毒素，是导致游泳者瘙痒的罪魁祸首:这种疾病的特征是眼睛和鼻子粘膜的炎症和肿胀。¹⁵由蓝藻细菌产生的其他一些毒素具有重要的医学意义，其中包括结节素、微囊藻毒素、柱状spermopsina、lingbyatoxin、脂多糖和失语症毒素，因为它们在哺乳动物中的目标器官包括肝脏、胃肠道、皮肤和任何暴露的组织。^{16日至18日}

由于不断采用基于行业的生活方式而导致富含产业的生活方式的污染物进入水生环境，因此促进蓝藻的生长，进入内陆水，这是全球范围内饮用水的重要来源。^14、19对氰毒素在娱乐和饮用水中效果的持续意识导致了许多关于在水生环境中检测氰毒素的有效方法的研究。^{20 - 22}有许多方法可用于在水生环境中发现氰化物，但大多数方法不容易获得，需要复杂的实验室专业知识使用。²²水生环境中氰化物的生物检测方法有很多，但这些方法在有效检测水中氰化物方面存在一定的局限性。^23日,24日本综述旨在总结在水生环境中发现蓝藻毒素的新方法，以及该方法在执行任务时的有效性。

水生环境中氰毒素的生物分析方法

蓝藻生物分析方法是指用于收集、存储、处理或分析蓝藻材料的方法。²⁵该方法用于水环境中氰化物的检测。²⁵用于检测氰毒素的两种主要生物分析方法是酶联免疫吸附测定（ELISA）和蛋白质磷酸盐抑制测定（PPIA）。酶联免疫吸附测定包括使用抗体鉴定水生环境中的氰霉素。²⁶这种方法易于使用，不需要使用复杂的实验室设备，在环境中氰化物的检测是有效的。ELISA可用于检测环境中极低浓度的蓝藻毒素(µ/l)。cyanotoxin的原则使用ELISA检测涉及到水的混合样本包含cyanotoxin用液体试剂在反应室是指井(图1)。包含反应物和防止溢出导致反应物之间的生化反应产生一个信号是用来确定在一系列的孵育和洗涤后，用分光光度计在450nm波长下从水生生物中收集的样品中氰藻毒素的浓度。²⁷用ELISA法检测水体中氰毒素的局限性在于，该方法不能识别水体中氰毒素的类型，且ELISA法不能准确测定水体中氰毒素的毒性水平。蛋白磷酸盐抑制试验是研究微囊藻毒素结合蛋白磷酸盐1 (PP1)和蛋白磷酸盐2A (PP2A)的潜力的一种生物学研究方法，但现在用于检测环境样品中微囊藻毒素和球素的作用。²⁸水生环境中的氰基毒素的PPIA方法是有效的，可测量低至0.1μg/ L的毒素浓度，该方法由于该方法的灵敏度而言，该方法已被证明是非常快速的，但PPIA没有可用的套件．²⁹PPIA方法高效，可以检测出超出ELISA和液相色谱-质谱(LC-MS/MS)检测限的毒素。²⁹利用PPIA检测氰酸毒素的数据与高效液相色谱(HPLC)的使用呈正相关。使用PPIA鉴定蓝藻毒素的局限性在于某些变体无法与蛋白磷酸盐酶反应，从而导致过高估计环境样品中的毒素浓度，或者有时无法检测到这种变体的存在。^30.

图1:用ELISA法检测水环境中氰化物毒素的示意图 点击这里查看图

水环境中氰毒素的分子检测方法

分子法是对蓝藻的脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、蛋白质和脂质进行检测和操作的一种方法。该方法是一种基于杂交和聚合酶链反应(PCR)的水生环境中氰毒素检测方法。杂交方法涉及到对形成藻华的蓝藻细胞的DNA序列之间存在的遗传相似性的测量。该方法可有效区分不同品种的蓝藻毒素，但由于时间长，实验室条件简单，难以实施，尚未在世界范围内应用。聚合酶链反应是另一种用于水环境中氰化物检测的分子方法，该方法涉及DNA序列的扩增，产生多个DNA片段副本，因此非常敏感。这种方法在水花出现之前就能有效地调查水样中氰化物的含量。摘要蓝藻毒素分子检测方法的局限性在于，当蓝藻的DNA受到轻微污染时，检测结果容易产生误导。用于PCR反应的酶也容易出错，这可能导致PCR片段的突变，这也导致了误导性的结果。^33节

水生环境中青紫毒素检测的生物学测定

生物测定法是一种利用活细胞或组织测定水环境中氰化物浓度的检测方法。该检测方法是基于对氰藻毒素对包括无脊椎动物、脊椎动物、植物和微生物在内的生物组织的影响的定性和定量测定。通过测定蓝藻毒素的LD50值，可用于肝毒素和神经毒素的鉴别。³⁴这些方法可以用来确定一种未知的氰化物毒素的毒性水平，因为在水生环境中已经建立了大量的氰化物毒素，尽管这些毒素的生物活性(强肝毒性、细胞毒性、酶活性以及免疫相互作用)由于蓝藻细菌产生的毒素的结构变异而不是很好的文件。水生环境中氰化物的生物测定方法包括利用微生物、无脊椎动物、脊椎动物和植物提取物。³⁵

使用无脊椎动物进行生物测定

然而，利用不同的实验技术，如存活率、摄食抑制、种群增长率等，蓝藻的毒性可以确定。在以水蚤为基础的生物测定中，破坏蓝藻的菌落或大菌丝是非常重要的，因为大菌落和大菌丝会对水蚤造成机械干扰和喂养不足，其死亡率可能不能反映蓝藻的毒性。³⁶此外，对6种微囊藻毒素同属物(包括MC-LR)进行了急性毒性和蛋白磷酸酶抑制试验Thamnocephalus platyurus，两种活性之间没有相关性。[D-Asp3， (E)-Dhb7] MC-RR毒性最高，但蛋白磷酸酶活性较弱。研究表明，除抑制蛋白磷酸酶外，其他器件在MC诱导毒性中起作用Thamnocephalus platyurus．还研究了蚊虫成年人以及幼虫的消费，作为与蓝藻毒素相反的可能的生物测定系统。幼虫伊蚊aegyptii被发现受到来自蓝藻细菌的神经毒素和肝毒素的影响。的成年人库蚊pipens被发现在注射时对MC-LR敏感。这两个蚊子相对微妙，但由于处理这种生物的并发症，尚未大致实施。同样，成人储物（苍蝇座sp。)、菱背蛾(Plutella.)及棉叶虫(Spodopterasp.)被发现对MC-LR敏感，自然样品的阳性结果与小鼠和各种杀虫剂的毒性结果相似。不过，这些苍蝇很难处理，需要进行显微注射，但很难注射。³⁷

利用脊椎动物进行生物测定

在过去的二十年中，小鼠生物测定法得到了广泛的应用，并且在微囊藻毒素的检测中仍然是首选的生物测定法。瑞士雄性白化小鼠仍然是测定蓝藻毒素毒性最常用的毒株。毒性是通过腹腔注射蓝藻细胞裂解液来检测的。如果注射量在0.5 ml或更大，最好使用生理盐水溶液制备的样品。取小鼠24 h后用颈椎脱位法处死。由于肝毒素表现出典型的肝损伤症状，观察期结束时必须对肝组织进行尸检。已知这些肝毒素可引起肝毒性症状，其特征是肝实质的变性和空泡化，充血和出血，以及肝空泡化。此外，在没有症状的情况下，或小鼠即使在观察期后仍然存活，也可以调查血清中关键的肝酶，如谷氨酸丙酮酸转氨酶(GPT)、谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT)、碱性磷酸酶(ALP)和乳酸脱氢酶(LDH)的泄漏情况。为此，在牺牲小鼠之前，从retro眶丛中收集血液，并可以使用商业诊断试剂盒在血清中研究肝酶。³⁸圆筒精子素表现为器官逐渐衰竭引起的症状，特别是肝、肾等器官，需要较长的观察时间。研究已经将急性肝毒性与严重的肝脏、肾脏和胸腺损伤与澳大利亚产圆筒精子素菌株联系起来。肝脏组织学检查仅发现中度和多灶性坏死。小鼠毒性称为LD₅₀每公斤小鼠体重的毒素或蓝藻干重为mg，每公斤LD₅₀< 1000mg干重的蓝藻被认为是无毒的。³⁹使用小鼠实验的第一个主要缺点是需要动物舍设施来饲养用于常规实验的动物。其次，在毒性研究中使用动物是违反科学道德的，实际上在大多数国家都是被禁止的。此外，如果环境中存在一种以上的氰酸毒素，较速效的毒素(即微囊藻毒素lr)可能掩盖其他症状。但蓝藻的总体毒性可以通过小鼠生物测定在饮用水供应中进行估计。蓝藻毒素对鱼类的影响还表现在肝脏损伤、离子调节紊乱、行为改变和死亡率等方面。据报道，幼龄的褐鳟、罗非鱼和鲤鱼是最敏感的鱼类，可以作为抗蓝藻细菌的测试系统。与小鼠生物测定不同，鱼类生物测定可能不容易和敏感。将蓝藻提取物注射到鱼类体内是一项艰巨的任务，而在含蓝藻提取物的培养基中浸泡可能需要更多的蓝藻提取物才能达到致死效果，而且通过多种解毒方式可以减轻口服毒性。与小鼠生物测定相似，蝗虫处理起来很安静，可以通过注射低剂量(10 μl)给药。以麻痹性中风为特征的结果在90分钟内获得。⁴⁰LD的₅₀对纯石蛤毒素的测定结果为8 μg g-1蝗虫体重，但对微囊藻毒素lr和尖胞藻毒素a不敏感。此外，选择的蛤蚌毒素类似物的相对毒性与在哺乳动物系统中报道的不同。作者讨论了利用蝗虫作为一种简单的、伦理上可接受的、广泛特异的功能生物测定法，用于监测石蛤毒素和其他麻痹性贝类毒素。⁴¹

生物测定使用细胞培养物

由于包括哺乳动物在内的大多数脊椎动物以各种方式受到有毒蓝藻的影响，使用培养的哺乳动物细胞而不是使用动物作为生物检测的合适替代品已经出现。微囊藻毒素是急性肝损伤的原因这一事实的确立鼓励了使用肝细胞(肝细胞)的研究。⁴²毒性是由一种关键的肝酶，乳酸脱氢酶(LDH)从肝细胞中泄漏决定的。⁴³通常，将分离的大鼠肝细胞与纯毒素或bloom提取物孵育一段特定的时间，然后使用(3,4,5 -二甲基噻唑-2yl)- 2,5 -二苯基溴化四唑(MTT)试验测定细胞的实用性。生物测定为微囊藻毒素结构变化的毒性比较提供了首次验证报告，表明MC-LR毒性最强，MC-RR的毒性至少是MC-LR的100倍。³⁹

使用植物和植物提取物的生物测定

由蓝藻和微藻产生的次级代谢物包括微囊藻毒素已被证明具有杀藻或除草的特性。生物测定使用Anacystis，Phormidium，Plectonema和小球藻已被用于研究颤藻属．然而，缺乏或没有文献存在成本效益和敏感的植物生物测定检测饮用水中的氰化物毒素。锅等。（2002）检测了微囊藻提取物对生长的影响Lepidium sativum.超过6天。暴露于10μgL-1微囊藻毒液-1R浓度导致根和叶长度的显着降低以及与对照组合时的幼苗的新鲜重量。³⁷植物中谷胱甘肽s -转移酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性也显著升高。研究表明Lepidium sativum.尽管除MC-LR和其他蓝藻毒素外的微囊藻毒素的影响尚未包括在研究中，但生物测定可用于微囊藻毒素。这种生物测定法的应用还需要大量的探索。柱状精子素对烟草花粉的萌发有负面影响。烟草简历萨姆松NN)。在5 ~ 1000 μg ml−1范围内，柱状精子素对花粉萌发有抑制作用。虽然该方法需要对水生环境样品进行预浓缩，但其对烟草花粉萌发的抑制作用可作为柱体精子素的生物测定方法。⁴⁴

酶生物测定

据报道，微囊藻毒素和结节素可抑制蛋白磷酸盐(PP) 1和2A。因此，蛋白磷酸酶抑制试验证明是一种筛选微囊藻毒素和结节素的精细方法。微囊藻毒素与PP1和2A结合同样良好。早期版本的PP1和2A生物测定是基于放射性标记底物释放的32p -磷酸盐的定量。这种生物测定方法对亚纳米克水平的微囊藻毒素和结节素敏感。该技术已成功应用于饮用水处理前后的环境样品中微囊藻毒素的定量分析。由于该方法具有足够的灵敏度，但由于使用了放射性底物，因而没有得到广泛的应用，这就需要专门的实验室设备和规范。⁴⁵

使用分析方法测定青氰苷酸

高效液相色谱法是检测水生环境中氰化物最可靠的方法，该方法可将毒素定性为毒素的种类和变异。⁴⁶高效液相色谱法在氰化物毒素检测中的局限性在于昂贵和难以获得。⁴⁷动物组织中氰酸毒素的浓度通常采用高效液相色谱(HPLC, LC)技术，结合紫外、光电二极管阵列(PDA)和/或质谱(MS)检测器进行测定。⁴⁸这些工艺允许根据保留时间进一步详细鉴定，但有进一步的限制，包括由于纯化、浓缩和缺乏商业氰化物标准而导致的检查时间延长。⁴⁹该方法不适用于低浓度、连续样品调查的氰酸毒素快速测定。采用HPLC-MS/MS直接水样注射法可快速检测水体中不同形态的蓝藻毒素，分析前不需要对样品进行纯化。^50岁的51研究了固相萃取（SPE） - 液相酯色谱（LC） - 质谱（MS）技术同时使用馏分并检测九氰酸辛，在水生环境中的氰毒素监测中是有效的。⁵²

基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术允许快速识别特定的微囊藻毒素变体。与高效液相色谱法或生物测定法相比，由于省略了纯化过程，该技术消耗的时间更少，并且需要更少的样品量(微克vs毫克)。³⁸气相色谱(GC)技术是建立在氧化的毒素,它将加入((2 s, 3 s, 8, 9) 3-amino-9-methoxy-2, 6日8-trimethyl-10-pheny1deca-4, 6-dienoic酸)侧链生产3-methoxy-2-methyl-4-phenyl丁酸(MMPB),然后被使用GC, GC / MS或高效液相色谱/荧光。⁵³Kaya和Sano(1998)的研究发现，该方法的检出限约为微囊藻毒素lr中表达的总微囊藻毒素浓度的0.4µg，但发现限取决于浓度水。采用毛细管电泳(CE)对含蓝藻毒素的生物混合物进行分离和定量，但与高效液相色谱法相比，其灵敏度较低。⁵⁴“瓦萨”号等等。，(2004)展示了CE在分析复矩阵中的应用。研究表明，该方法应与胶束电动色谱等分析方法相结合。根据微囊藻毒素的紫外光谱特征，采用薄层色谱法(TLC)检测微囊藻毒素，类似于HPLC中的PDA检测。⁴⁶有适当的探测系统;分离组分的紫外光谱可以被记录。用薄层色谱分离微囊藻毒素。⁵⁵薄层色谱法可以定量测定毒素的含量，但还需进一步研究。采用实时荧光定量PCR技术对水生环境中的毒素基因进行了定量分析⁵⁶．⁵⁷建立了一种同时使用的快速且精确的方法，作为定性和分子技术，可用于检测藻类繁殖群落中众多物种。该方法设计为14种特异性探针和4组特定引物。使用流式细胞仪和颜色编码的微球的珠阵法测定多次同时检测，该珠阵列方法与显影探针缀合。在平行双PCR扩增之后，在单重反应中接合通用引物和多重检测中的一组特异性引物，在成本效益和高度的分析中实施。在单个样本中可以同时识别该多格式小于4小时，以完成样品收集和最多100种不同的物种。⁵⁵

结论

对水生环境中氰化物的定量方法包括生物分析方法、分子方法和生物测定方法进行了比较，并对分析方法在水生环境中氰化物定量中的应用效率进行了比较。虽然分析方法在水环境中氰化物的测定是非常有效的，但这些方法需要高水平的实验室技能和专业知识，而生物分析方法、分子方法和生物测定方法是高度敏感的，可方便、有效地定量测定水生环境中的蓝藻毒素。这些新技术是预防藻华毒性的重要工具，因为它们能够在藻华发生之前检测出水生环境中微毒素的存在。这些研究还表明，水生环境中氰化物的生物检测方法具有一定的局限性，尽管需要较高的技术水平，但分析方法仍是水生环境中氰化物检测的最佳选择。因此，建议开展更多的研究，以消除使用生物方法检测水生环境中的氰化物所带来的挑战。

确认

第一和第二作者感谢巴耶罗大学卡诺分校的生物科学系。

资金

提交人没有对本文的研究，作者和/或出版本文的财务支持。

的利益冲突

作者没有任何利益冲突。

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