当前的世界环境

介绍

用于保护作物的农药导致现代世界的作物产量增加。然而，不科学使用各种类型的农药，直接和间接地影响了环境中的各种类型的生命。持续的有机氯农药（OCP）在上世纪持续应用，以提高农业生产力。这些OCP是持续的有机污染物及其代谢物仍存在于具有致致致癌和致癌作用的环境中。¹

硫丹（6,7,8,9,10,10-10-六氯-1,5,5a，6,9,9a-六羟基-6,9-甲基-2,4,3-苯并二氧化钛）首先是generation Organochlorine pesticide introduced in 1950’s and approved for use in 1954 in USA. It exists in two isomers as α-Endosulfan or Endosulfan (I) and β-Endosulfan or Endosulfan (II) in the ratio 7:3 having almost similar insecticidal activities, but have significant differences with respect to their physicochemical properties.^2-4它是一种广谱杀虫剂，用于水果、蔬菜、棉花和观赏植物上防治白蝇、蚜虫、叶蝉、马铃薯甲虫、蛾幼虫和卷心菜虫。^5.硫丹及其有毒残留的硫酸硫酸盐用于生物累积，可以多种方式进入食物链。两种异构体和硫丹的其他代谢物如图1所示。

图1：硫丹异构体的结构及其主要代谢物 点击此处查看数字

由于其对大多数生物体的毒性和生物累积性质的高毒性和生物累积性质，并被证明从其原始来源运输到环境中的远距离，影响偏远的人类和野生动物人群通过哺乳动物的性腺毒性，遗传毒性和神经毒性。^6-7印度是一个70％endosulfan的市场价值约为3亿美元，是通过7500万农民每年消耗9,000吨的最大消费者，使其拥有世界上最大的消费者。由于对人类和其他非靶毒性有毒的毒性，自2011年以来，它已被禁止在印度的生产，使用和销售。由于其疏水性，持续性和生物致讨的性质，硫丹强烈地绑定到土壤，其残留物将留在土壤中较长的时间。^8.早期的研究表明，在印度和世界各地的各种农业土壤、水和其他环境样本中存在硫丹异构体和硫丹硫酸盐。^9-13这些发现表明了硫丹及其代谢物和其他农药对各种环境样品的污染。

硫丹被应用于腰果树上，以保护他们免受蚊虫，Belthangady，Surlia和达克西岛，卡纳塔卡，印度卡纳塔克卡州的村庄的蚊虫虫。超过30万六千升的硫丹在该区的八五十（850）公顷的腰果种植园中，并且根据1980 - 2000年的Karnataka Cashew Development Corporation Ltd，加入了11千升。所施用的杀虫剂留在土壤中较长的时间。硫丹的半衰期被认为超过百年。^14.

生物修复或生物沉默是一种使用微生物去除毒性污染物的ECOFriendly方法。报告通过使用微生物进行硫丹生物降解的一些研究。^15-23细菌和真菌被认为是潜在的候选者去除污染物，它们是否将其用于代谢。^24.能够从受污染的土壤中去除毒物的土着细菌和真菌作为优异的生物沉积剂，并且它们不会对其他原生植物和动物群构成任何严重威胁。^25.在这方面，进行本研究以孤立能够完全降解的土着细菌。

材料和方法

土壤采样

卡纳塔克卡·卡纳纳·坎塔达区的Kokkada，Patrame and Nidle村庄的Cashkada，Patrame和Nidle村庄的土壤样本是几十年的土壤暴露于硫丹的土壤。从同一领域的腰果种植园中收集土壤样品（图2。）。）。将收集的土壤样品保持在标记的聚乙烯盖中并向实验室进行实验分析。然后，将样品风干，通过2mm滤网筛分并在4℃下储存直至进一步使用。表1中显示了基本土壤特性。

化学物质

分析级α-硫丹（99.6％）和β-胚乳（99.8％）从Sigma-Aldrich Co.，USA获得，并用作标准。在HPLC等级中单独制备每种异构体的储备溶液（100ppm）N.- 通过将分析物的约1mg（Acculab Alc210.4）称为10ml容量烧瓶中并稀释成体积的己烷。库存标准溶液在-20℃下储存在黑暗中。制备工作解决方案，如所要求的^26.。

图2:硫丹取样位置图 在达克斯岛kannadadistrict，卡纳塔克邦，印度 (地图不按比例尺)。 点击此处查看数字

表1：从硫丹污染场地收集的样品的基本土壤特征。

硫丹降解菌的富集与分离

对于分离，从达克西岛克南地区的硫丹污染点收集的1g土壤样品，接种到含有100ml非硫介质（NSM）的250ml Erlenmeyer烧瓶中（G / L）K.₂HPO._4.0.225g，kh.₂宝_4.0.225 g,在北半球_4.Cl 0.225 g, MgCl₂.6H.₂O 0.845 g, CaCO_3.0.005g，feCl.₂.4h₂O 0.005，D-葡萄糖1.0Gm和1ml痕量元素溶液（Mg / L）MnCl₂.4h₂o 198mg，zncl₂136毫克，CUCL.₂.2H₂O 171mg，Cocl₂.6H.₂o 24mg，nicl₂.6H.₂o 24mg.^[27]在pH7.5的唯一碳源以及100mg / L肠源，并在37℃下以120rpm孵育7天。孵育7天后，用100mg / lendosulfan将1ml样品加入100ml新鲜培养基中。在第四份富集后，将样品涂布在矿物质培养基（1.5％琼脂）的平板上用100mg / L硫丹涂布。分离的纯净有效的菌株在形态学上表征和生物化学，与Bergey的系统性细菌手册进行了比较^28.。

生物降解研究

选择纯有效的菌株，其显示为ES-1指定为ES-1的NSM琼脂板上的生物降解。为此，将含有100mL NSM培养基的250ml烧瓶接种菌株ES-1的细胞粒料（10mL过夜培养物在15mL离心管中取出，并以5000rpm离心10分钟。然后，丢弃上清液并丢弃上清液用1ml无菌NSM培养基溶解细胞粒料，并在无菌上加入烧瓶中），以及70mg / L的α异构体和30mg / L的β异构体，并在37中孵育来自培养基的杀虫剂的提取到^29.有轻微的修改。孵育7 d后，取35ml液体介质于50ml离心管中。试管10000 rpm离心5min，用石油醚摇瓶法分离上清液。然后，有机水层通过(~2克)无水硫酸镁。之后溶液被旋转蒸发器浓缩(Bucchi型，GG Technologies，印度)。同样，在孵育14天后，用同样的方法提取样品。将残渣溶于高效液相色谱级正己烷中，采用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)进行分析。

最佳降解研究

根据菌株ES-1进行硫丹的最佳降解条件^30.有轻微的修改。通过不同的温度（37℃）和不同浓度的硫丹（100,250＆500mg / L）进行降解研究。所有的实验在含有NSM介质的250ml烧瓶中进行，其中硫丹唯一的碳源。在14年底检查培养基的pH值^th天。实验以三份酸盐以及对照进行。根据上述方案进行萃取。

微观研究土壤中硫丹硫醇的降解研究

在土壤微观研究中，土壤样本采集自迈索尔大学校园，这里以前没有使用过任何农药。收集的样品用2mm的筛网筛除碎屑。然后，将100克土壤样品放入250毫升Erlenmyer烧瓶中，在121⁰C下蒸压20分钟。该过程重复三次，使土壤不受所有其他微生物的影响。随后，在土壤样品中添加100 mg kg^-1硫丹，接种含有10^6.细胞组合^-1的芽孢杆菌sp。ES-1。同样地控制烧瓶而不添加细胞培养物。将烧瓶孵育为7-14天。通过加入10ml无菌水，定期润湿烧瓶。然后根据含量提取残基¹通过摇瓶方法。在250mL Erlenmeyer烧瓶中取出10g土壤，加入50ml石油醚和丙酮（1：1，v / v）并在水平振荡器中进行过夜。后来，过滤萃取物并保持蒸发烧杯中的干燥。后，将残余物溶于1mL的HPLC级正己烷中，并通过GC-MS分析。

残留分析

GC-MS分析在7890A GC系统（Agilent Technologies，Inc）上进行了连接到配备电子喷雾电离（ESI）检测器的Synapt G2 HPMS MS（Waters，USA）的质谱。GC柱由30m×0.250mm（Agilent Technologies，Inc）组成的HP-5MS毛细管柱。根据GC-MS编程。^31.烘箱温度被编程为在10°C min的120℃至320℃下增加到320℃^-1。使用全扫描模式在70eV中记录质谱。通过比较内标的保留时间来监测样品中存在的硫丹的定性分析。进行了恢复研究以评估上述程序的效率。发现硫丹异构体的平均回收率分别为α和β硫丹的93％和91.2％。

诱导菌株ES-1（DNA分离和16S rDNA扩增）

根据菌株分离DNA^32.根据可根据聚合酶链式反应（PCR）进行16S rDNA基因的16S rDNA基因的扩增³³，向前（bs f：gagtttgatcctggctca gg）和反向（bs r：tcatctgtcccaccttcggc）。通过互联网爆炸基因数据库（http：// www.ncbi.nlm.nih.gov）分析DNA序列，并将序列提交给Genbank。稍后，将部分测序数据提交给GenBank并获得了登录号KX230063。

结果与讨论

胚乳降解细菌分离物的分离

用于分离微生物培养的土壤富集方法导致细菌菌株的分离，这可以耐受高浓度的硫丹。在三个村庄样本中，我们能够孤立来自PatraLy Village的细菌。在富集培养基中重复连续的亚培养后，通过表明利用硫丹作为生长基质，指定为ES-1的微生物分离物在那里显示出显着的生长。

识别ES-1

ES-1被鉴定为革兰氏阳性骨质厌氧Bacilli.形状（图3。），非运动，过氧化氢酶阳性，并在NSM琼脂上呈现奶油白色菌落形态与硫丹。将分离的DNA进行PCR扩增。基于16S RDNA序列，将细菌鉴定为芽孢杆菌SP.。使用Mega软件的邻近加入方法构建的系统发育树显示出菌株-1（KX230063）99％查询盖芽孢杆菌thermoamylovorans（kj842641）（图4。）。然而，其他分子证据将进一步研究以结束菌株ES-1芽孢杆菌thermoamylovorans。

图3：在下面观察到的细菌分离es-1的微观图像 光学显微镜(Allwin scientific)，印度[油浸(100X)] 点击此处查看数字

使用细菌分离ES-1生物降解硫丹

使用细菌菌株ES-1.GC-MS分析评估使用细菌分离的细菌分离物ES-1兼容硫丹异构体（α＆β）的生物降解显示，在孵育14天后，菌株ES-1能够完全代谢硫丹形成任何已知的中间体。结果基于GC-MS色谱图获得的峰总数的比较分析。，（图5a）。色谱仪'A'的A'ERPRESTENTS的标准硫丹的总离子色谱仪，保留时间为11.21的α-硫烃和11.74β​​-硫丹，具有M / Z 406（图5b。）。色谱仪'c'（图5c。）代表在与M / Z 390孵育14天后从烧瓶中取出的样品。

图4：构建的系统发育树 16S rDNA部分序列比较 来自Genbank的菌株及最高凶残 （括号中的登录号）。 点击此处查看数字

在以硫丹为硫源的矿物介质中，能够去除亚硫酸盐基团并以硫丹为硫源的生物将存活和繁殖。^30.它还导致降低化合物的毒性，这有助于解毒化合物。已经研究了各种细菌和真菌病症中的硫丹异构体的微生物降解已经大大研究。据报道，硫酸亚硫酸硫酸盐硫酸盐，硫酸盐二醇，硫酸硫丹醚，硫丹单醛和硫丹二烷二醛作为硫丹异构体的微生物降解期间形成的主要代谢物。^23,34这两种分析都强烈支持ES-1Strain的完全降解硫丹。

最佳的生物降解研究表明，菌株在55℃下的优异生长显示，而不是在37℃（未示出的数据）。结果表明，芽孢杆菌sp。ES-1是酸性土壤中存活的嗜热细菌。菌株，ES-1显示在100mg / L（图5）下的最大降解> 90％（图5。），并且是在相同浓度的高效硫丹的生物学生。在孵育14天后将培养基的pH降低至酸性（表-2）。在100mg / L浓度中观察到pH的降低而不是250-500mg / L的硫丹。许多其他研究人员也观察到硫丹降解期间从中性期间对酸性的降低。^6日,35这可能是由于产生的代谢活性增加，导致形成酸性代谢物。

图5A：标准α的GC-MS，总离子色谱图（TIC）和 β硫脲B。硫丹C的质谱C）质量碎片 14天后获得的代谢物 点击此处查看数字

菌株芽孢杆菌sp。ES-1遵循水解途径，用于生物降解而不形成任何已知的代谢物。这些结果表明，菌株ES-1采用硫丹生物降解的水解途径，³⁶与硫酸硫酸硫酸盐生物降解的氧化途径相反。^37-39.在降解过程中培养介质中没有任何特定的代谢物积累可以通过形成一些极性代谢物来提示硫丹可能完全矿化。类似地，在硫丹降解期间没有观察到代谢物根癌土壤杆菌PT-3表明通过独特的基因和酶组利用杀虫剂作为碳源的可能性。^20.AchromobacterxyloxidansC8B还能够在浓度为50ppm的浓度为20 ppm的浓度下矿物化硫丹和硫丹硫酸盐的异构体^th液体培养基中的孵育。^30.细菌菌株的硫丹完全矿化葡萄球菌sp。，芽孢杆菌circulans研究了I和II已经研究过。这些菌株被发现是硫丹的优异降解及其代谢物。杀虫剂的矿化可能含有水解途径，导致形成碳离子或乙基羧酸盐，其后来将转化为简单的烃。⁴⁰

图6：NSM中应变ES-1的生长条件 不同浓度的硫丹 点击此处查看数字

表2：在孵育14天后观察到pH的降低（初始pH7）。

生物降解能力芽孢杆菌对土壤中sp.ES-1菌株的α和β异构体(100 mg/kg)硫丹进行了检测。该分离物在7天内降解50%化合物，14天后观察到完全矿化。未检测到累积产品。而对照瓶萃取液显示出两种同分异构体m / z.423对应于硫酸末硫酸盐质量。这清楚地解释说，该菌株在硫丹的矿化中遵循水解途径。在非生物的条件下，化合物将其氧化成硫酸盐。先前的研究表明，通过水解，异构体均得到水解成硫醇醚和二醇^27.通过氧化硫酸盐硫酸盐⁴¹。混合的细菌联盟能够在不形成任何已知的中间代谢物的情况下矿化成硫丹的异构体⁴⁰对比这个;硫酸硫酸盐由芽孢杆菌sp。⁴²能够在没有形成有毒副产物的情况下除去杀虫剂的杀虫剂的菌株应在生物沉积或生物修复中实现，而不是形成毒性副产物的菌株⁴³。目前工作的结果显示，分离ES-1完全没有形成任何有毒的副产物的硫丹的异构体。因此，它用作优异的生物沉积剂。这芽孢杆菌SP ES-1可以在降解需要进一步研究的异构体中含酶。

结论

硫丹异构体和硫酸硫酸盐对人类和环境有毒，在土壤中持续更长的时间。土着细菌菌株芽孢杆菌发现sp.es-1完全降解硫丹。硫酸硫酸盐，中间体化合物通常在降解过程中累积，这通常被认为是没有检测到母体化合物的毒性和持久性。从这些结果中，我们得出结论，本土菌株ES-1可用作生物沉积剂，以将以高浓度的硫丹污染的土壤消除。

承认

作者感谢科技系（DST）-Science和工程研究委员会（Serb），印度政府，获得收到的赠款（SB / EMEQ-041/2013）开展这项工作和卓越机构（IOE），Mysuru大学Mysuru，用于提供气相色谱 - 质谱（GC-MS）。

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