当前世界环境

介绍

有机磷农药最常用于农作物生产、城市卫生和病媒控制的害虫管理。¹毒死蜱[O,O-二乙基-O-(3,5,6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酸酯]是一种广谱杀虫剂，广泛用于防治瘿蚊、地瓜虫、玉米根虫、夹叶虫、叶蝉等。²毒死蜱有多种剂型，如颗粒剂、湿表粉、可粉尘粉和可乳化浓缩物。^3.

含有空气，地面水，水体和土壤的综合和巨大用法和处理紫杉醇。过量的农药使用导致农作物，土壤和生物圈中的农药残留产生生态压力。⁴环境保护局已经提交了许多关于毒死蜱污染水和陆地生态系统的报告。⁵研究人员报告说，pH值、温度、有机碳含量、水分含量和农药配方等因素的变化会影响毒死蜱在土壤中的半衰期，从10天到120天不等。3,5,6-三氯-2-吡啶醇（TCP）是一种主要的降解产物，其水溶性大于毒死蜱，导致土壤和水环境的广泛污染。⁶在海洋沉积物，农业土壤，溪流，河流，城市风暴排水管，淡水湖泊，地下水，雾，雨水和空气中，已经在海洋沉积物，农业土壤，溪流，河流，淡水湖泊。⁷

由于毒死蜱对哺乳动物的高毒性和在农业部门的广泛使用，使用微生物降解毒死蜱特别令人关注。生物降解被认为是一种可靠的、经济有效的农药减排技术，是决定有机磷农药在环境中命运的主要因素。⁸拍马屁等, 1999⁹报道说节细菌属毒死蜱在无机盐培养基中降解，该细菌最初从富含甲基对硫磷的土壤中分离得到。采用浓缩过程¹⁰分离出六种毒死蜱降解菌。许多毒死蜱降解细菌包括属的成员节细菌属sp。¹¹肠杆菌应变B-14,¹²Alcaligenes粪群落DSP3,¹³克雷伯菌sp．，¹⁴鞘粉sp. Dsp-2，¹⁵假单胞菌铜绿假单胞菌ncim 2074，¹⁶Bacillus pumilusC2A1,¹⁷Pseudomonas普蒂达MAS-1,¹⁸铜绿假单胞菌sp。¹⁹已从受农药污染的环境中分离出来。

本研究的主要目的涉及利用富含富集培养技术和通过液体培养基中的细菌分离物中含有富集培养技术和降解紫外紫外紫外线的紫杉紫外线细菌的分离和鉴定。该研究旨在阐明孤立的细菌菌株的可能就业以进行含毒死蜱污染的环境的修复。

材料和方法

土壤样本的集合

采集了印度喜马恰尔邦西姆拉区Theog址苹果园土壤中各种农药污染的土壤样本，毒死蜱在该地区广泛用于防治各种害虫。土壤样品采自土壤表层10-15cm深度，用消毒抹刀采集。^20.采集了三份样品，并将其带到实验室进行进一步实验。

化学品和媒体

Sigma-Aldrich，瑞士中获得氯吡啶（O，O-二乙基O-（3,5,6-（3,5,6-三氯-2-吡啶基）硫代磷酸酯）（99.6％纯分析级）。从USPLECO分析中获得甲基硫磷样品（99.9％纯度）。矿物盐培养基（MSM）用于致毒性降解细菌的富集，分离和表征。¹⁰MSM由（G / L）1.5g K2HPO组成₄、0.5 g KH2PO4、0.5 g (NH4)2SO4、0.5 g NaCl、0.2 g MgSO4、0.05 g CaCl2、0.02 g FeSO4, 1升蒸馏水，pH 7.0。灭菌通过高压灭菌介质在121°C和15 psi下进行15分钟。

富集技术与分离

将土壤样品在室温下在室温下干燥，并将水分含量保持在近20％（w / w）。将这些土壤样品筛过2毫米网。在250ml erlenmeyer烧瓶中加入约10g土样品，含有50ml矿物盐培养基（MSM），含量为10mg / L浓度的氯吡啶。将样品在37℃和150rpm的振荡器培养箱上在黑暗中孵育一周。在孵育一周后，将10ml培养物转移到烧瓶中，用新鲜的MSM，具有30mg / L浓度的氯吡啶，再孵育另一周。将进一步的1ml培养物转移到用50mg / L氯吡啶摩洛斯的新鲜MSM中，并在37℃和150rpm孵育另一周。然后通过涂抹板技术和条纹板法分离紫外线降解以及抗性细菌纯培养物。将100μl富集的培养物在琼脂固化MSM上涂覆在玻璃培养皿中用50mg / L氯吡啶乳糖加固，并在24小时后在37℃下孵育，在培养基上出现的细菌菌落纯化，然后保持在MSM琼脂中，在4℃下倾斜，在-20°C下作为甘油股。

细菌分离株的紫外线抗性曲线

在含有不同浓度的氯吡啶的含量范围为50-800mg / L的矿物盐培养基上，将每种选定的偶氮降解细菌分离物。²¹将分离的细菌在毒死蜱强化的MSM琼脂平板上划线，在37℃下培养48小时。然后选择在最高浓度毒死蜱下表现生长的细菌分离物进行进一步研究。

紫杉虾降解细菌分离的特征

对对毒死蜱最高浓度具有耐受性的分离菌株进行了形态学鉴定，并对其进行了甲基红和Voges-Proskauer (MR-VP)、过氧化氢酶、柠檬酸利用、氧化酶、脲酶、Casin水解酶、葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵等生化试验。从Bergey系统细菌学手册中对细菌分离物进行分类鉴定，并通过16S rRNA基因测序进一步确认。采用基因组DNA提取试剂盒- mini (Real Genomics)提取选定菌株的总基因组DNA。采用纳米滴分光光度计(Nanodrop ND1000, Thermo Fisher Scientific, USA)定量DNA。利用通用引物27f (5- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，正向)和1492r (5'- ggttaccttgttacgact -3，反向)进行16S rRNA基因扩增。使用全自动测序仪(Genetic analyzer 31030, Accessories Applied Biosystems)进行测序。利用EzTaxon服务器，鉴定系统发育邻居，计算16S rRNA的配对相似性[22]。系统发育分析采用MEGA6软件包，CLUSTALW对公共数据库数据进行多次比对后进行。²³

毒死蜱降解OPH活性的定量筛选

用定量方法对所选菌株进行有机磷水解酶（OPH）活性的进一步筛选。细菌细胞在1.0升Luria Bertani（LB）培养基中培养过夜。使用隔夜培养的细菌分离物获得培养上清液，浓度为8000 x g，4^°C处理10分钟，进一步作为粗胞外酶。洗涤细胞微丸两次，然后重悬于含有0.1 mmol/l苯甲基磺酰氟(PMSF)的50 mmol/l Tris-Cl (pH 8.0)缓冲液中。细胞分裂通过超声10次，每次10秒，每15秒间隔，使用(数字Sonifier-MP Biomedical)。取未破碎的细胞，15000 × g离心30分钟，取细胞游离上清作为粗胞内酶。细胞内和细胞外粗酶制剂用于进一步的定量分析。²⁴

将100μl粗细胞内和细胞外酶制剂加入到900μl50mmol/ L Tris-Cl（pH9.0）的测定缓冲液中，其与5.0μl10mg/ ml甲基脱硫作为基材，并在37℃下温育10分钟。通过加入1.0ml 10％CCl 3核酸（三氯乙酸），然后加入1.0ml 10％Na 2 CO 3进行显色作出的终止。使用光谱仪（Perkin Elmer Lambda 25），在410nm波长下记录吸光度。根据金额p- 硝基苯酚（PNP）计算水解和酶活性的产物。OPH活性的一个单位定义为释放1.0μmol的酶量p- 37℃/分钟的硝基苯酚。

分析性程序

接种物的制备

使用矿物盐培养基培养细菌菌株AST2.2并升高到指数相，然后通过在室温下以5000g离心5分钟收集。用灭菌的MSM洗涤细胞粒料两次并调节至约3×10⁸降解实验的CFU/ml。

矿盐介质(MSM)的接种与强化

含有3×10的百μl细菌培养悬浮液⁸CFU/ml接种到装有20 ml含400 mg/l毒死蜱的最低培养基的烧瓶中。以未接种的小瓶(含400 mg/l毒死蜱)作为对照。在37ËšC恒温箱中培养不同的时间间隔(0、24、48、72和96小时)。

提取和分区

进行液体液萃取方法，用于从细菌培养中提取氯吡啶和其残留物。将含紫紫外含有培养物转移到分离漏斗中，向培养基中加入20ml正己烷。将混合物剧烈摇动4-5分钟，并保持不受干扰，直至进行两种液体的分离。将样品萃取三次，并将正己烷层收集在250ml锥形烧瓶中。在旋转蒸发器上蒸发提取物在50℃下，在使用真空泵的压力下几乎干燥，残余物在2.0-5.0ml正己烷中重新溶解在无菌玻璃瓶中的2.0-5.0ml正己烷中，用于GC测定。

色谱测定

在Shimadzu GC-17A气相色谱仪上进行各种提取物的GC-FID分析。柱尺寸为30米×0.25mm的内径，具有Optima-5（Macherey-Nagel）毛细管柱。毛细管塔的组成为5％苯基-95％甲基吡咯烷烷。分析在分离模式下以1:10比率进行。柱和注射器温度在300℃下保持在300℃，分别在400℃下保持，检测器温度保持在450℃。柱压为77kPa，柱流量为1.0ml / min柱，总流动为12ml。使用的载气是氮气。¹⁸计算植物萎缩率的百分比计算如下：

毒死蜱降解量=原始添加量-回收量



气相色谱-质谱法测定毒死蜱中间体

使用TRACE 1300GC tsq8000进行气相色谱-质谱分析。TRACE 1300GC tsq8000安装有可分可分的进样器，并与三重四极质谱仪连接。采用TG-5 MS毛细管柱(30 m × 0.25 mm, 0.25 μm，含5%苯甲基聚硅氧烷)(J&W Scientific, Santa Clara, CA)进行分离。²⁵氦气(99.99%)以1 ml/min的恒定流速作为载气。在split less模式下(5分钟)，注入器温度保持在250ºC，烘箱温度程序如下:初始温度100°C(保持2分钟)，20°C / min至180°C, 10°C / min至250°C(保持2分钟)。GC-MS分析总时间为15分钟。采用电子电离模式进行质谱电离，并在70 eV下记录光谱。GC-MS界面设置为250ºC，离子源温度设置为200ºC。总离子电流(TIC)图谱记录在40-500之间m / z.．通过质谱(MS)与美国国家标准技术研究所标准库(NIST-07)的质谱数据进行比较，鉴定GC后获得的各成分。

结果与讨论

在我们的研究中，使用选择性富集方法将来自苹果果园土壤的紫外线降解细菌与以前的紫外线使用历史分离出来。在紫外线选择压力3周后，在矿物盐琼脂培养基上仅分离出三个细菌分离株，50mg / L氯吡啶疗法。许多研究人员报告分离氯吡啶降解细菌和土壤的真菌。^{12日,13日,26日2}少数研究人员还报告分离来自污泥和废水的氯吡啶降解细菌来自农药制造单元。^{15日,27日,19}

通过在补充有不同浓度（50-800mg / L）作为碳和能量唯一来源的MSM中，通过将它们的MSM生长在三个分离物中选自有效的紫紫外异性降解细菌分离物。分离物AST2.2能够耐受800mg / L氯吡啶，并显示出高达400mg / L氯吡啶的生长，并选择该分离物进行进一步研究（表I）。以前报道的研究人员也观察到细菌可以耐受和生长高浓度的氯吡啶。^21,27

表1:不同浓度毒死蜱在无机盐琼脂培养基中的抗性谱

+ =生长，±=斑驳的生长， - =没有增长

菌株AST2.2菌落的颜色奶油，圆形纹理和整个边距。菌株AST2.2是革兰阴性，杆状，严格的有氧，非孢子成形和运动。菌株AST2.2对葡萄糖，氧化酶，柠檬酸盐利用，尿素和发酵的生化试验进行了阳性结果，但对乳糖和蔗糖发酵，吲哚利用，明胶液化，酪蛋白水解，甲基红色和雾化剂的消极的生化试验。基于各种形态学和生化特征，将细菌分离酶Ass Ask3.2鉴定为属的成员假单胞菌按标准协议设置在贝尔奇的确定性细菌手册中。²⁸通过16S rRNA基因部分测序(1231bp)和BLASTn分析进一步证实了这一点，结果显示，与种间的相似性达到99%以上假单胞菌．16S rRNA测序已被有效地用于细菌种类的分子鉴定。研究人员使用16S rRNA测序鉴定毒死蜱降解细菌分离物。^{12日,10日,29日,27岁}

eztaxon用于分析16S rRNA基因序列，以基于成对核苷酸相似值和系统发育推理方法来实现分离物的鉴定^.30,22利用EzTaxon服务器鉴定菌株ASK3.2的16S rRNA序列为假单胞菌树脂瓦拉斯由于其16S rRNA序列表现出97.70％的相似之处假单胞菌树脂沃纳诺瓦兰人lmg2274 (T)Z76668)。将AST2.2的测序结果提交至GenBank国家生物技术信息中心(NCBI)数据库，获得登录号为KP322753.1。图1用PHYLIP分析16S rRNA的结果。

图1：系统发育关系假单胞菌树脂瓦拉斯AST2.2基于部分16S rRNA序列 点击这里查看图

假单胞菌树脂瓦拉斯菌株AST2.2表现出细胞外和细胞内的有机磷水解酶活性。48小时后，细胞外OPH活性为0.157U/ml，而细胞内OPH活性仅为0.068U/ml。我们的结果与宁丰的结果一致等。，2004年[24]谁报道了OPHC2活性0.208 U / mL和0.198 U / mL假性产碱假单胞菌，从有机磷处理的土壤中分离出来。这说明OPH酶可能存在于菌株AST2.2的细胞膜内或胞外分泌。此前报道的结果表明，OPHC2酶被发现位于细胞膜上假单胞菌pseudoalcaligenes²⁴和药物酶假单胞菌diminuta。³¹

使用岛津GC-17A气相色谱仪，采用配备火焰离子化检测器（FID）的气相色谱仪对间隔24小时96小时后采集的样品进行分析。使用液体MSM进行了气相色谱研究，结果如表二和图二至图七所示，表明残余毒死蜱的回收率。我们的毒死蜱在矿物盐介质中降解的结果与Ajaz报告的结果一致等, 2012¹⁸在哪里Pseudomonas普蒂达MAS-1用于降解。发现随着时间的推移，逐渐减少了残留的氯吡啶的回收率。

表2：矿物盐培养基中的残留氯吡啶酵母的百分比升值假单胞菌树脂沃纳诺瓦兰人菌株AST2.2

在对照样品（无任何菌株）中，在保留时间RT 16.03时记录标准毒死蜱峰，峰高542502.30。试验样品中（接种假单胞菌菌株AST2.2），在室温范围内记录紫外线峰值，从16.04〜15.98，发现峰值高度随着时间的增加而降低，表明MSM中的氯吡啶量减少。还观察到，RT值随时间（0-96小时）的增加而降低。据透露了这一点假单胞菌树脂瓦拉斯AST2.2迅速降解紫外线，0小时后紫外线回收率为99.78％，96小时后逐渐降低至MSM的56.10％。观察到菌株AST2.2不能在MSM生长（表II）中的前24小时期间在前24小时内使用/降解作为菌株在接种到培养基中的早期生长相中。假单胞菌树脂瓦拉斯AST2.2在96小时后降解了43.90%的400 mg/l毒死蜱，该菌株以毒死蜱为底物，同时也作为碳和能量的来源。

肠杆菌菌株B-14在48小时内降解了40％的25mg / L氯吡啶，¹²寡养单胞菌sp. YC-1在24小时内降解100%为100 mg/l。¹⁰Bacillus pumilus菌株在5天内降解50 mg/l毒死蜱，留下9 mg/l农药¹⁷和粘连囊肿菌株PUPCCC 64在5天内降解了93.8%的5 mg/l毒死蜱，³²这些菌株能将毒死蜱水解成TCP。

图2：具有16.03保留时间（RT）和峰值高度542502.30的标准氯吡啶的GC-FID峰 点击这里查看图

图3：0HRS后GC-FID喉紫外线峰值假单胞菌树脂瓦拉斯菌株AST2.2RT为16.04，峰高为541329.30 点击这里查看图

图4:GC-FID毒死蜱在24小时后的峰值假单胞菌树脂瓦拉斯菌株AST2.216.02 RT，峰高499401.66 点击这里查看图

图5：48小时后GC-FID氯吡啶峰峰假单胞菌树脂瓦拉斯菌株AST2.2与16.00 RT，峰值高度409507.40 点击这里查看图

图6：72小时后GC-FID喉峰假单胞菌树脂瓦拉斯菌株AST2.2与RT为15.99，峰高为357849.18 点击这里查看图

图7:96小时后的GC-FID毒死蜱峰值假单胞菌树脂瓦拉斯菌株AST2.2RT为15.98，峰高为304361.51 点击这里查看图

氯吡啶的中间体测定

降解研究后，采用气相色谱-质谱（GC-MS）技术对样品进行分析。总离子电流色谱图记录在40-500 m/z之间，共965次扫描。对照样品和试验样品都产生了类似的碎片离子（96.9196.9285.9313.9m/z）。GC-MS分析显示对照样品中毒死蜱的R.T.为11.13分钟（图VIII）。锂等.， 2010[25]采用固相微萃取-气相色谱-质谱联用(GC-MS)检测地表水中23种有机磷农药，发现毒死蜱在保留时间(RT)为11.41±0.01。通过与NIST-07质谱数据库标准库的比较，确定了该样品在R.T 11.11时的质量电荷比与相对强度与毒死蜱标准谱的匹配(图ix)。一种可能的代谢物，即磷酸二乙基3,5,6-三氯-2-吡啶酯(C₉H₁₁Cl_3.不₄P)注明CAS号。5598-15-2与11.11 RT检测样品中的毒死蜱一起通过NIST文库检索鉴定。气相色谱-质谱分析结果表明毒死蜱进一步降解为较小的中间体，这些中间体在现有的图书馆数据库中无法识别。结果表明毒死蜱可能已被分离株完全代谢为较小的中间体。Kumar 2011,³³和Barathidasan等。，2014年，³⁴还报告了GC-MS分析后的类似结果，因为毒死蜱降解后的较小中间体未被鉴定。

图8对照(未接种)48小时后毒死蜱总离子电流色谱和质谱图 点击这里查看图

图9：48小时孵育后，紫外线的总离子电流色谱和质谱假单胞菌树脂瓦拉斯矿物盐培养基中的菌株AST2.2 点击这里查看图

结论

以生态修复为目的的生物修复/生物降解技术正在得到广泛应用。假单胞菌树脂瓦拉斯菌株AST2.2可用于毒死蜱污染土壤的生物修复

确认

作者承认院长，园艺学院，Y.S.院长的财务支持。巴马特园艺大学，索伦（H.P.）。

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